李 倩，教 杨，刘 淇，张 媛，赵 玲，孙慧慧，曹 荣,*
（1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 266071；
2.广州工商学院工学院，广东 广州 510850；
3.獐子岛集团股份有限公司，辽宁 大连 116001）
海参是药食同源的典范，食用历史悠久，保健功效深入人心。随着国民经济的发展和人均可支配收入的增加，吃海参逐渐成为人们日常养生的一种潮流。与此同时，海参养殖技术不断进步和完善，有力推动了海参产业的快速发展。2021年全国仿刺参总产量达22.27 万t[1]，全产业链产值估算超1 000 亿元。海参营养功效与加工一直是国内的研究热点。“十五”以来，科研人员先后在海参自溶机制与控制、海参功能成分与构效关系解析、海参加工技术与产品标准等方面取得了重要进展。与此同时，海参加工产业依旧面临一些问题，尤为突出的是海参在加工过程中会产生30%左右的副产物（海参肠、性腺、呼吸树等组织），目前利用率极低[2]，部分甚至直接丢弃，既浪费资源又污染环境。
海参性腺，俗称海参花，富含优质蛋白质以及海参多糖、海参皂苷、功能脂质等活性成分[3]，是生产功 能性海洋制品的潜在原料。科研人员从海参性腺中提取到多种活性物质，并验证了其功能活性，如体外抗氧化活性[4]、抗肿瘤[5]及促进生殖系统健康[6-7]等。而目前有关海参性腺在免疫调节方面的研究报道还非常少。常年吃海参的人群不易感冒，普遍认为与食用海参可以提高人体免疫力有关[8]，通常人们食用的部分为海参体壁。而仿刺参性腺是否具有免疫功效，目前尚没有相关的研究证明。由此，本研究以仿刺参雌、雄性腺为原料，对其基本营养组分和主要功效成分进行测定，采用小鼠饲喂实验，通过分析脏器指数、血清生化指标、肝脏生化指标等考察仿刺参性腺在小鼠免疫力调节方面的作用，以期为仿刺参性腺的精深加工与产品开发提供依据。
1.1 材料与试剂
仿刺参雌、雄性腺由青岛海滨食品有限公司提供，系2020年春季采捕仿刺参时现场分离得到，雌、雄性腺分别分装于样品袋中，立即冷冻处理。SPF级雄性昆明小鼠，体质量（20.0±2.0） g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。
Hank’s液、RPMI1640等细胞培养液 海克隆生物化学有限公司；
胎牛血清 赛默飞世尔科技有限公司；
小鼠淋巴瘤YAC-1细胞 中国科学院细胞库；
2-巯基 乙醇 宝日医生物技术有限公司；
青霉素、链霉素 上海生物工程股份有限公司；
红细胞裂解液 北京索莱宝科技有限公司；
噻唑蓝 美国Sigma公司；
浓盐酸、氯仿、甲醇、磺基水杨酸、氢氧化钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；
灌胃器、注射器、冻存管、96 孔培养板、无菌滤器 青岛阿贝特仪器科技有限公司。
乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒 南京建成生物工程研究所；
小鼠白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-6、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒 上海酶联生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
G50型组织研磨器 卡尤迪生物科技有限公司；
Spectra Max i3x型酶标仪 美国Molecular Devices公司；
DHG-9423A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏设备有限公司；
UV-2802型紫外-可见分光光度计 尤尼柯仪器有限公司；
MARS Xpress型微波消解仪 美国CEM公司；
5810R型冷冻离心机 德国艾本德公司。
1.3 方法
1.3.1 样品制备
仿刺参雌、雄性腺分别真空冷冻干燥处理，研磨成粉末，备用；
体壁切块后进行真空冷冻干燥处理，研磨成粉末，备用。将仿刺参雌、雄性腺鲜样分别匀浆，制得匀浆液备用。
1.3.2 基本化学成分与功效成分测定
蛋白质含量测定：参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[9]中的凯氏定氮法。脂肪含量测定：参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》[10]中的索氏提取法。灰分含量测定：参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》[11]中的高温灼烧法。海参多糖含量测定：参照常耀光[12]的方法。海参皂苷含量测定：参照高子阳等[13]的方法。
1.3.3 小鼠饲喂
小鼠预饲1 周，之后随机分为3 组，每组20 只，即：对照组、饲喂雌性性腺组（灌胃仿刺参雌性性腺匀浆液）、饲喂雄性性腺组（灌胃仿刺参雄性性腺匀浆液）。每周测定小鼠体质量，灌胃剂量按照 2.6 mg/（g·d）计算，对照组灌胃同等体积的蒸馏水。连续灌胃30 d，饲喂结束后进行各项指标测定。
1.3.4 脏器指数测定
摘取小鼠胸腺和脾脏，分别称质量，胸腺指数和脾脏指数分别按式（1）～（2）计算。
1.3.5 自然杀伤（natural killer，NK）细胞活性率测定
实验前24 h将靶细胞YAC-1进行传代培养，用Hank’s液洗3 次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液，经200 目筛网过滤，用Hank’s液洗2 次，3 500 r/min离心10 min弃上清，加入0.5 mL细胞裂解液20 s，再加入0.5 mL 2 倍Hank’s液及8 mL Hank’s液，1 000 r/min离心10 min，用1 mL含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，稀释后进行活细胞计数，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL，作为效应细胞。同时设定靶细胞孔和效应细胞孔。细胞于37 ℃、5% CO2培养箱中培养后，用酶标仪在490 nm波长处测定光密度（OD），NK细胞活性率按式（3）计算。
1.3.6 血清生化指标测定
末次灌胃后禁食不禁水12 h，小鼠称质量，摘眼球取血，静置30 min，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，取血清。按照试剂盒说明书步骤，测定血清IL-2、IL-6、TNF-α、MDA、GSH含量及LDH、SOD活性。
1.3.7 肝脏生化指标测定
取血后小鼠脱颈处死，无菌环境下，取脾脏、胸腺和肝脏，冷生理盐水清洗，称质量。肝脏匀浆，按照试剂盒说明书步骤，测定匀浆液中的GSH、MDA含量及SOD、LDH、CAT活性。
1.4 数据处理
营养和功效成分含量测定实验重复2 次，每次3 个平行，小鼠实验结果为20 个样本的平均值，结果用平均 值±标准差表示。使用SPSS软件的Duncan’s法进行组间差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。
2.1 仿刺参性腺基本营养组成与功效成分
由表1可知，仿刺参雌、雄性腺与体壁的蛋白质、脂肪、灰分含量以及海参多糖、海参皂苷含量有明显差别。三者的蛋白质含量有显著差异（P＜0.05），其中雄性性腺蛋白质含量最高，而雌性性腺蛋白质含量最低，这与张健等[14]的研究结果类似。仿刺参体壁的脂肪含量较低，而雌、雄性腺的脂肪含量均显著高于体壁（P＜0.05），尤其是雌性性腺的脂肪含量达到15.93 g/100 g，是体壁的近4 倍。雌、雄性腺的灰分含量均显著低于体壁（P＜0.05），这与仿刺参体壁含有内骨骼及沙嘴有关。
表1 仿刺参性腺与体壁基本营养成分与功效成分含量（干基）Table 1 Basic nutrients and functional compounds contents in gonads and body wall of Apostichopus japonicus (on a dry basis)g/100 g
海参多糖和海参皂苷是海参特有的功能活性成分，已被证实具有多种生理功能[15]。与仿刺参体壁相比，雄性性腺中海参多糖含量显著偏低（P＜0.05），而雌性性腺的海参多糖含量与体壁相当。雌性性腺的海参皂苷含量高达4.77 g/100 g，是体壁的10 倍以上。因此，仿刺参性腺在功能食品方面具有良好的开发利用前景。
2.2 小鼠体质量与脏器指数
由表2可知，小鼠饲喂30 d后，体质量明显增加，但3 组小鼠的终体质量并无显著差异。胸腺的主要功能是产生T淋巴细胞和分泌胸腺素，参与细胞免疫。脾脏中有丰富的B淋巴细胞和巨噬细胞，与体液免疫关系更为密切。胸腺指数和脾脏指数升高，表明免疫器官内淋巴细胞数量增多，可在一定程度上反映机体免疫功能的强 弱[16]。喂食仿刺参雄性性腺的小鼠，脾脏指数和胸腺指数均显著增加（P＜0.05）；
喂食雌性性腺的小鼠，脾脏指数显著增加（P＜0.05），胸腺指数同样有所提高，但与对照组相比差异不显著。由此可知，仿刺参雌、雄性腺对小鼠的免疫功能均可起到一定的促进作用，且雄性性腺的效果相对更好。
表2 小鼠体质量及脏器指数Table 2 Body mass and organ indices of mice
研究表明，海参中的多种成分都具有提高免疫力的作用，如海参多糖[17]、海参皂苷[18]、海参肽[19]等。食品原料本身是一个复杂体系，多组分之间可能存在协同效应[20]，且这种协同作用对整体功效的贡献可能更大。因此，对原料本身而非纯化组分开展功效研究同样十分必要。李艳菊等[21]研究发现，食用海参可显著提高小鼠的体液免疫应答功能；
陈垚[22]将海参冻干粉与茯苓、枸杞等配伍，同样发现其具有理想的增强免疫力效果。
2.3 NK细胞活力
NK细胞在生物体非特异性免疫中有重要作用，其杀伤作用不需要预先免疫或致敏，且杀伤作用早于其他效应细胞，在抗病毒、抗肿瘤及免疫调节方面有积极作用，同时可以调节T淋巴细胞、B淋巴细胞等[23]。因此，发现可增强NK细胞活性的化合物具有重要意义。
由图1可知，饲喂仿刺参性腺的小鼠，其NK细胞活力显著提升（P＜0.05），且饲喂雄性性腺组提升更为明显，经测定其NK细胞活性率可达（47.19±4.99）%，表明仿刺参性腺在提高小鼠免疫力方面具有积极作用，这与脏器指数的检测结果一致。
图1 饲喂仿刺参性腺对小鼠NK细胞活力的影响Fig. 1 Effect of feeding Apostiopsis japonicus gonads on NK cell activity of mice
2.4 血清生化指标检测结果
白细胞介素是对免疫功能有重要调节作用的一类细胞因子，在传递信息、激活与调节免疫细胞以及炎症反应中起重要作用。其中，IL-2对淋巴细胞的生长、增殖、分化起促进作用，可以激活巨噬细胞，刺激免疫应答[24]。IL-6主要由活化的T细胞和成纤维细胞产生，能加快B细胞转化、促进原始骨髓源细胞的生长和分化，增强NK细胞裂解功能等。由表3可知，饲喂仿刺参性腺的小鼠，其IL-2含量略有增加，但与对照组相比差异并不显著，而IL-6含量变化更为明显，其中饲喂仿刺参雄性性腺组的IL-6含量显著增加（P＜0.05）， 为（209.75±24.82） pg/mL。
表3 饲喂仿刺参性腺对小鼠血清生化指标的影响Table 3 Effect of feeding Apostiopsis japonicus gonads on serum biochemical indices of mice
TNF-α主要由脂肪组织中的巨噬细胞和脂肪细胞分泌产生，与免疫调控、抑制肿瘤细胞生长有关。杨东达[25]从海参内脏中分离出SCVP-1和SCVP-2 2 种多糖组分，发现SCVP-1可以显著提高小鼠血清中TNF-α含量，增强小鼠免疫活性。饲喂仿刺参性腺的小鼠，其血清中TNF-α含量略有增加，但与对照组相比差异并不显著，雌性性腺组对应的TNF-α含量增加更为明显，可能与雌性性腺中海参多糖的含量更高有关[26]。
SOD是存在于机体内的一种可清除超氧自由基的酶，其活性不仅在一定程度上反映了机体抗氧化和抗衰老作用的强弱，还可在一定程度上反映机体免疫活性，如抗炎症能力等[27]。与对照组相比，饲喂雄性性腺的小鼠，其SOD活力显著升高（P＜0.05），为（18.61±0.28） U/mL。饲喂雌性性腺的小鼠，其SOD活力也略有升高，但与对照组相比差异不显著。LDH存在于组织细胞内，其主要功能是将运动所致肌肉中堆积的乳酸转变为丙酮酸，减少乳酸在肌肉中的堆积。LDH活力越高，表明机体对运动时所产生的乳酸清除能力越强，进而延缓疲劳的发生或加速疲劳的消除，间接提升机体的免疫功能。饲喂雌性性腺、雄性性腺的小鼠，其LDH活力均显著提升，分别达（391.01±32.18）、（379.12±18.44） U/L（P＜0.05），且饲喂雌性性腺的小鼠提升更为明显，这可能与雌性性腺富含极性脂质有关。雌性性腺中脂质含量高达15.93%，其中磷脂、鞘脂类占有相当比例，而海参磷脂可显著提高生物体SOD、LDH活力[28]。
自由基是影响生物体免疫系统的重要因素。机体中的自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，形成MDA等脂质过氧化物[29]。MDA具有细胞毒性，能加剧膜损伤，引起蛋白质、核酸等大分子的交联聚合，导致细胞代谢及功能障碍。与对照组相比，饲喂雄性性腺可显著降低血清中的MDA含量 （P＜0.05），这与SOD活力提高的结果相一致。
付雪媛等[30]研究认为，海参可改善小鼠的抗氧化能力，同时提高免疫力，具体表现为MDA含量减少、SOD活力提升。饲喂雌性性腺也可在一定程度上降低血清中的MDA含量，但与对照组相比差异不显著。
2.5 肝脏生化指标检测结果
由表4可知，肝脏生化指标检测结果与血清类似。饲喂仿刺参雄性性腺组的小鼠，其SOD、LDH活力显著提升（P＜0.05）（（6.32±0.31） U/mg和（246.77±26.10） U/g），MDA含量显著下降 （P＜0.05），为（1.98±0.25） nmol/mg。CAT存在于动物的各个组织中，尤其在肝脏中大量存在，是肝脏发挥抗氧化、解毒等作用的物质基础。饲喂仿刺参雄性性腺组的小鼠，CAT活力略有提高，但与对照组相比差异并不显著。GSH由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成，广泛存在于机体细胞中，可维持免疫系统正常功能，并具有抗氧化、解毒的作用。饲喂仿刺参雌性性腺、雄性性腺的小鼠，其GSH含量均有所增加，且雄性性腺组增加更为明显。Meng等[31]研究发现，海参中的蛋白肽可提高机体抗氧化能力、增加GSH含量。仿刺参雄性性腺蛋白含量高，该组的小鼠肝脏GSH含量增加可能与之有关。
表4 饲喂仿刺参性腺对小鼠肝脏生化指标的影响Table 4 Effect of feeding Apostiopsis japonicus gonads on liver biochemical indicators of mice
仿刺参性腺富含营养和功效成分，且雌性性腺和雄性性腺化学组成有明显不同，雌性性腺富含脂肪和皂苷，而雄性性腺蛋白含量较高。与对照组相比，饲喂仿刺参雄性性腺的小鼠，其胸腺指数和脾脏指数显著增加（P＜0.05），分别为（4.70±0.36）、（3.70±0.29） mg/g，NK细胞活性显著提高 （P＜0.05），达（47.19±4.99）%，血清中IL-6含量显著增加（P＜0.05），为（209.75±24.82） pg/mL，血清和肝脏中LDH、SOD活力均显著提升（P＜0.05），肝脏MDA含量显著降低至（1.98±0.25） nmol/mg （P＜0.05）；
饲喂仿刺参雌性性腺的小鼠，脾脏指数为（3.14±0.26） mg/g（P＜0.05），血清LDH活力显著提升（P＜0.05），达（391.01±32.18） U/L。由此可知，饲喂仿刺参性腺可提高小鼠的免疫活性，且饲喂雄性性腺的作用更加明显。