猪博卡病毒VP1蛋白的多克隆抗体制备及初步应用

张韬，李茂林，邹抒洁，Manita Aryal，刘光亮，付钰广

(中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046)

猪博卡病毒(porcine bocavirus，PBoV)于2009年由瑞典科学家在研究断奶仔猪多系统衰竭综合征时首次被发现，由于其基因序列与人博卡病毒基因序列具备较高的亲缘相似性，因而将其以猪博卡病毒命名[1-2]。PBoV主要感染猪的呼吸道及肠道，引起感染猪只腹泻和呼吸系统疾病，临床中该病毒常与多种其他猪肠道病原混合感染，使猪腹泻的防控难度大大增加，其中仔猪有较高的感染率和死亡率，该病毒对养猪业可造成一定的经济损失[3-4]。

PBoV属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒亚科(Parvovirinae)博卡病毒属(Bocaparvovirus)成员[4-5]。该病毒是一种单链线性的DNA病毒，无囊膜，体积较小，结构简单，呈二十面体轴对称[5-6]。病毒基因组包含3个开放阅读框(ORF1、ORF2和ORF3)，转录翻译4种蛋白质VP1、VP2、NS1和NP1。根据相关研究，NS1、NP1比较保守，而VP1、VP2较易发生突变[7-8]。VP1和VP2相互重叠形成病毒的衣壳，VP1分布于病毒衣壳的外层，VP2位于病毒衣壳内层[9-10]。有研究表明VP1蛋白与VP2蛋白相比，其在N端包含一个VP1蛋白独有的蛋白区域，此区域在功能方面对细小病毒的感染起重要作用[11-12]。

目前，PBoV在中国的猪群中被大量检出，其感染率可达到38%以上，分布广泛[13]。但该病毒的入侵机制和相关生物学特性尚不明确。为深入研究该病毒的感染入侵特性，本研究利用大肠杆菌系统表达PBoV VP1蛋白，制备其多克隆抗体，为进一步研究其功能奠定基础。

1.1 主要试验材料

原核表达载体pET-28a(+)、真核载体pcDNA3.4购自优宝生物，日本大耳白兔来源于中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，大肠杆菌感受态细胞 BL21(DE3)、DH5α均由本实验室制备，DNA Marker、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司，IPTG购自SIGMA，限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和KpnⅠ以及T4 DNA连接酶购自Thermo Fisher公司，HRP标记的山羊抗兔IgG购自达科为生物有限公司，ISA206佐剂购自法国Seppic公司。Ni-NTA蛋白纯化试剂购自GE公司。

1.2 VP1蛋白原核表达引物的设计与合成

在GenBank中获得PBoV的基因组序列(序列号：MN481505.1)，根据将要构建到的pET-28a(+)载体的多克隆位点设计针对VP1基因的原核表达引物：上游引物VP1-F：5′-CCGGAATTCATGAG TCATAAGCGCGGTCA-3′(酶切位点为EcoRⅠ)；
下游引物VP1-R：5′-CCCAAGCTTTTACAG TACCTTCTCCCTCCCC-3′(酶切位点为HindⅢ)。扩增引物由西安擎科生物有限公司合成。

1.3 VP1蛋白重组原核表达质粒的构建

用特异性引物以PBoV的基因组为模板，进行PCR扩增，使用试剂盒进行VP1基因PCR产物的纯化，接着配制酶切体系，用EcoRⅠ和HindⅢ对纯化的VP1基因PCR产物与pET-28a(+)载体分别进行双酶切，再用T4 DNA连接酶，将目的基因引入pET-28a(+)载体，将连接产物无菌操作转化至DH5α后涂板，挑单个菌落至液体LB中增殖菌体，做菌液PCR鉴定，将鉴定阳性菌液进行测序鉴定并将重组质粒命名为pET-28a-VP1。

1.4 VP1蛋白的原核表达和复性

将重组质粒pET-28a-VP1转化至BL21(DE3)中,，涂板后挑取单菌落至液体LB培养基进行37 ℃摇床培养增殖菌体，测OD600为0.6～0.8时，加入合适浓度IPTG诱导剂，诱导蛋白表达8 h。离心菌液并收集菌体，于冰浴中超声裂解菌体，将离心超声后的菌体分别保留上清液和沉淀，分装适量的样品，经处理后加入SDS-PAGE胶进行电泳，经SDS-PAGE鉴定蛋白是否表达。将超声后的含有蛋白样品的沉淀，用8 mol/L尿素充分溶解，用除菌滤器过滤，将过滤液置于提前处理好的规格合适的透析袋中，依次置于6 mol/L、4 mol/L和2 mol/L尿素的梯度透析液(0.1 mol/L NaH2PO4、0.01 mol/L Tris，pH值8.0)中，4 ℃条件下在各个梯度透析液中透析复性12 h，复性的蛋白经SDS-PAGE鉴定。

1.5 VP1蛋白的纯化

在亲和层析柱中加入树脂(HIS标签)并对亲和层析柱中的树脂进行洗涤和平衡，将上述透析结束的蛋白加入纯化柱，于4 ℃冰箱中过夜结合。之后将样品自然流出，再用10倍柱体积的洗液洗涤树脂，最后于层析柱中加入2 mL洗脱液室温作用10 min并收集洗脱液，操作过程严格按照试剂盒说明书说进行。收集的蛋白经SDS-PAGE检测其洗脱效率，同时经Western blot鉴定蛋白纯化效果。

1.6 动物免疫

将复性后的VP1蛋白与ISA206按1∶1体积的比例进行混合，将乳化后的抗原通过背部皮下多点注射对日本大耳白兔进行免疫，每只免疫500 μg，分别在初免2周后和4周后以相同的剂量对试验兔进行第2次和第3次加强免疫。于各次免疫前后采集试验兔耳缘静脉血分离血清，做ELISA检测针对VP1的抗体水平变化。收集最终免疫后的兔血清，与上述检测方法一样，孵育不同稀释比的VP1多克隆抗体，以间接ELISA的方法检测抗体滴度。

1.7 VP1基因重组真核表达载体的构建

为验证所制备的抗血清的反应性，将VP1目的基因利用引物VP1-His-F：5′-CCGGGTACCAT GAGTCATAAGCGCGGTCAGT-3′(酶切位点为KpnⅠ)和VP1-His-R：5′-GGCAAGCTTTTAGTGGTGA TGGTGATGATGCAGTACCTTCTCCCTCCCC-3′(酶切位点为HindⅢ)进行扩增，酶切纯化后克隆入真核表达载体pcDNA3.4，将重组质粒按正确步骤转化至DH5α感受态细胞，静置、热激后加入900 μL无抗LB增殖菌体，涂板后挑取单菌落到液体LB中摇菌，经菌液PCR鉴定，对阳性菌液测序鉴定并将重组质粒命名为pcDNA3.4-VP1。

1.8 VP1蛋白的真核表达及鉴定

将空载体pcDNA3.4和重组质粒pcDNA3.4-VP1用PEI转染试剂分别转染至准备好的HEK-293T细胞中，36 h后弃去细胞上清并加入NP-40裂解液裂解细胞，处理样品后经Western blot检测蛋白表达。分别以His标签抗体为一抗，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗进行孵育，通过ECL发光试验检测目的蛋白的表达状况。

1.9 VP1多克隆抗体的反应性检测

将空载体pcDNA3.4和重组质粒pcDNA3.4-VP1分别转染HEK-293T细胞，36 h后，加入裂解液，收集并处理细胞样品后，经Western blot验证制备的多克隆抗体与真核表达的VP1的反应性。分别以制备的VP1多克隆抗体或His标签抗体为一抗，以山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG抗体作为二抗孵育，通过ECL发光试验验证多抗的反应性。此外，对转染空载体pcDNA3.4或重组质粒pcDNA3.4-VP1的HEK-293T细胞做间接免疫荧光试验(IFA)，以多克隆抗体作为一抗，以Alexa Flour488山羊抗兔 IgG抗体为荧光二抗，加DAPI染料后于荧光显微镜下观察荧光信号。

1.10 VP1多克隆抗体反应原性分析

为验证制备的多克隆抗体与PBoV粒子的反应性，用实验室保存的PBoV感染的猪肠道内容物灌服感染新生仔猪，待仔猪出现腹泻症状后，采集仔猪小肠组织。取适量组织，其中一部分用于进行病毒的PCR检测(引物：F: 5′-TGGATAATAATGAACAAG-GGGC-3′，R: 5′-TTCATTGCG GATAGGACACC-3′)，另一部分肠组织用组织冷冻剂包埋置于液氮中冷冻组织，然后利用冰冻切片机制备4 μm厚度的组织切片并贴附于载玻片上，经固定、透膜和封闭处理后，以制备的VP1多克隆抗体或免疫前兔阴性血清作为一抗，Alexa Flour488山羊抗兔 IgG抗体为荧光二抗，加DAPI染料后于荧光显微镜下观察荧光信号。

2.1 重组质粒pET-28a-VP1的构建及鉴定

对VP1基因的PCR扩增产物经核酸电泳可见符合预期大小条带(2 046 bp，见图1A)。含有重组质粒pET-28a-VP1的DH5α感受态细胞菌液经菌液PCR核酸电泳鉴定，可看到2 000 bp左右与预期结果一致的条带(见图1B)。对pET-28a-VP1进行测序，经序列比对发现，重组质粒pET-28a-VP1中VP1基因序列与参考基因序列完全一致，证明已成功构建pET-28a-VP1重组质粒。

M. DNA Marker；
A.PCR扩增；
1为VP1；
B.PCR鉴定；
1为pET-28a(+)-VP1,2为pET-28a(+)-VP1图1 VP1基因原核表达载体的克隆构建及验证

2.2 VP1蛋白的原核表达和复性

对本试验的原核表达条件进行了探索，在37 ℃分别以IPTG浓度为0.1～0.8 mmol/L诱导蛋白表达8 h。

离心收集菌体，超声裂解菌体离心后制备上清液和沉淀样品，经SDS-PAGE后，考马斯亮兰染色鉴定。结果表明：诱导后蛋白样品存在于沉淀中而不在上清液中，在75 kDa左右出现符合预期大小的条带(见图2A和图2B)；
选取IPTG 浓度为0.6 mmol/L 诱导蛋白大量表达，鉴于VP1蛋白以包涵体形式表达，选择尿素梯度透析法对VP1蛋白进行复性，经SDS-PAGE分析，透析前后的VP1蛋白在75 kDa处条带清晰(见图2C)。

A. 不同浓度IPTG诱导蛋白表达；
M为蛋白Marker，1、3、5、7为0、0.1、0.4、0.6 mmol/L IPTG诱导表达后的上清液样品，2、4、6、8为0、0.1、0.4、0.6 mmol/L IPTG诱导表达后的沉淀样品；
B. 0.8 mmol/L IPTG诱导蛋白表达；
M为蛋白Marker，1、2为终浓度为0.8 mmol/L IPTG诱导后的上清液和沉淀样品,3为pET-28a(+)载体)；
C. 蛋白复性前后SDS-PAGE鉴定；
M为蛋白Marker，1为VP1复性前，2为VP1复性后图2 不同浓度IPTG诱导VP1蛋白表达的SDS-PAGE分析

2.3 VP1蛋白纯化和鉴定

将上述透析后的目的蛋白通过Ni-NTA亲和层析的方式纯化，并经SDS-PAGE的方法检测蛋白纯化效果。结果显示已成功纯化VP1蛋白，蛋白条带约75 kDa，与预期相符(见图3A)；
纯化的蛋白经Western blot鉴定，结果显示在75 kDa附近存在特异性条带(见图3B)。

A. 蛋白纯化SDS-PAGE鉴定；
B. 蛋白纯化Western blot鉴定；
M为蛋白Marker，1为pET-28a(+)空载体蛋白，2为纯化后的VP1蛋白图3 纯化的VP1蛋白SDS-PAGE(A)和Western blot鉴定

2.4 VP1蛋白多克隆抗体的制备

将适量佐剂加入纯化后的目的蛋白并充分混合乳化，对日本大耳白兔进行3次免疫，每次免疫前后，从实验兔耳缘静脉采血并分离血清，用VP1蛋白包被酶标板，通过ELISA分析检测抗体滴度。结果显示，VP1蛋白免疫后小鼠血清的抗体水平经多次免疫后呈上升趋势(见图4A)。对最终收集的兔多克隆抗体进行滴度检测，结果显示，在稀释至12 800倍时仍具有良好反应性(见图4B)。

A.VP1基因扩增；
B.重组质粒PCR鉴定;M. DNA Marker,1为VP1，2～6为pcDNA-3.4VP1;C.重组VP1的真核表达鉴定；
1为pcDNA3.4-VP1，2为pcDNA3.4，3为HEK-293T图5 VP1蛋白真核表达载体的构建及鉴定

2.5 VP1真核表达载体的构建及鉴定

用PCR方法成功扩增了VP1目的基因(见图5A)，将其克隆入真核表达载体pcDNA3.4并经PCR验证，可以看到符合预期大小的条带(见图5B)。重组质粒测序结果显示与目的序列完全一致。将重组质粒pcDNA3.4-VP1转染HEK-293T细胞，Western blot鉴定结果显示，VP1蛋白在HEK-293T细胞中成功表达(见图5C)。

A.抗体水平变化;B.抗体滴度检测；
数据为“平均值±标准差”图4 VP1蛋白多克隆抗体的制备及滴度检测

2.6 VP1多克隆抗体与真核表达蛋白的反应性

为了验证本研究所制备的多克隆抗体的反应性，对转染pcDNA3.4-VP1质粒的HEK-293T细胞裂解液进行Western blot鉴定。分别以本研究制备的阴性兔血清、VP1多克隆抗体以及内参抗体作为一抗，结果显示，VP1多克隆抗体能与裂解液中的VP1蛋白发生反应产生特异性条带，而用阴性兔血清中由于没有针对VP1的抗体产生，所以未能检测到VP1蛋白(见图6A)，说明本研究制备的VP1多抗特异性较高。同时，用IFA鉴定VP1多克隆抗体，将上述转染的细胞进行固定，以VP1多克隆抗体和阴性兔血清作为一抗进行孵育。结果显示，多克隆抗体试验组可以检测到明亮的绿色荧光信号，而阴性对照组未能检测到荧光信号(见图6B)。

A.Western blot 验证；
B. IFA验证图6 VP1多抗与真核表达的VP1蛋白反应性分析

2.7 VP1多克隆抗体与组织感染病毒粒子的反应性

为验证本研究所制备多克隆抗体与PBoV粒子的反应性，本研究提取感染PBoV猪只小肠组织DNA后进行PCR检测，核酸电泳鉴定结果显示，存在符合特异性引物所检测基因分子量大小的特异性条带，约为250 bp(见图7A)；
同时制备小肠组织冰冻切片，分别以VP1多克隆抗体和兔阴性血清进行孵育，经IFA检测，结果显示VP1多克隆抗体组有较明显荧光(见图7B)，表明此次研究所制备的VP1多克隆抗体能与PBoV粒子反应。

M. DNA Marker；
1. 阴性对照；
2. 阳性对照；
3. 小肠组织图7 猪小肠组织中PBoV的PCR检测

图8 组织中PBoV IFA验证

当前许多大型养猪场都检测到PBoV的流行，此病毒同时伴随着断奶仔猪多系统衰竭综合征以及蓝耳病暴发，严重威胁着养猪业的发展[2,14]。目前对PBoV的研究多集中在流行病学调查和检测方法的建立，已报道的检测方法有IFA、PCR和荧光定量PCR(qPCR)等[15-18]，但对该病毒的机理研究甚少。本研究制备了一种特异性较强的针对PBoV VP1蛋白的兔多克隆抗体，用于猪只感染PBoV的分析鉴定，为后期研究PBoV的感染特性及致病机理奠定了物质基础。

VP1蛋白作为PBoV基因组编码的主要衣壳蛋白，其在病原入侵过程中扮演重要角色，机体产生的针对该蛋白的抗体，可为宿主提供一定的针对该病毒的保护性[9]。有研究表明博卡病毒的VP1基因长度约2.1 kb，共编码671个氨基酸，且包含一段5′端独有的VP1-U序列，该序列是保守的“YXGXF”结构域，大小约为387 bp，含有129个氨基酸，此区域含有的磷脂酸A2序列与病毒感染相关，对病毒DNA进入细胞核这一过程起关键作用，而目前对PBoV的VP1蛋白功能研究甚少[4]。本研究成功构建了VP1蛋白的真核表达质粒及制备了有效的多克隆抗体，为VP1蛋白的功能性研究提供了物质材料。

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