周贝妮，梅慧玲，李建杰，陈伶俐，衷青，李小倩，陈暄*，黎星辉*
1. 南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095；
2. 南京农业大学资源与环境学院，江苏 南京 210095
铝作为地壳中含量最丰富的金属，在酸性土壤中会以可溶性离子的形式从不溶性硅酸铝或氧化物中释放出来[1]。浓度极低的铝离子也会抑制大多数植物的根系生长[2]。植物中铝毒引起所有的症状都与根系的严重变化有关[3]，主要表现为迅速抑制根系生长，干扰根尖和侧根的细胞分裂，造成根系受损、数量减少，因此根系的生长情况也被用于衡量植物的耐铝性。Sjogren等[4]研究表明，铝会造成细胞周期停滞、根尖末端停止分化等，从而导致根系伸长受到抑制，这些过程都与铝损害了 DNA完整性有关。
茶树是一种较为特殊的经济作物，适宜在酸性土壤中生长，并对铝有很高的耐受性，甚至必须有铝元素才能实现最佳生长[5-6]。在一定的铝浓度处理下，茶树根的生长（包括主根、侧根和根毛）显著增加，而地上部的生长基本不变，说明铝更能有效地促进茶树根部的生长，且茶树可以承受至少1 mmol·L-1铝浓度，而不会对正常生长产生负面影响[7]。铝还能够刺激液体培养的离体茶树根和简单盐溶液中悬浮培养的茶叶细胞的生长[8]，这表明铝能够刺激茶树生长，而且这种生长效应还能够发生在组织和细胞水平上。刘腾腾等[9]研究表明，茶树根系主要分泌草酸、柠檬酸及苹果酸，约占有机酸分泌总量的 90%；
而在 2 mmol·L-1铝浓度范围内，茶树分泌的多种有机酸水平随铝离子浓度的增加而升高[10]。
磷是酸性土壤的主要限制养分[11]。由于磷离子较易与金属阳离子形成离子对或络合物，导致土壤中只存在极少数的可溶性磷离子。多项研究表明，磷在许多土壤中的有效性，尤其是在酸性土壤中的有效性，远远不能满足植物生长[12]，土壤中有效磷浓度通常为 0.01 mmol·L-1或更低[13]。另一方面，由于磷肥或有机肥的施用量过多，一些茶园出现了磷浓度过高的现象[14]。Yan等[15]报道，在高生产力的茶园中，表层土壤有效磷含量高达 400 mg·kg-1。阮宇成等[16]测定了不同磷铝浓度下茶树叶片的各项指标，包括叶片的光合速率、叶绿素含量等，提出最适宜茶树生长的铝磷比值。由此可见，环境中磷铝浓度与茶树的生长密切相关。
因此，本研究通过分析不同磷铝浓度下茶树根系生长情况、茶树不同部位磷铝两元素含量以及茶树根系有机酸分泌的变化情况，以期进一步阐明磷铝互作对茶树生长的影响，并对茶树根系发育、茶树对磷铝两元素的吸收及茶园土壤酸化提供理论支持，为丰富茶树栽培提供理论基础。
1.1 试验材料与试验设计
供试茶苗为半年生龙井长叶扦插穴盘苗。水培试验于2021年7月6日—9月2日在南京农业大学人工气候温室内进行，营养液参照文献[17]进行配制，(NH4)2SO4、Ca(NO3)2·4H2O、KH2PO4、K2SO4、CaCl2、MgSO4、Al2(SO4)3·18H2O浓度分别为0.375、0.25、0.05、0.95、0.395、0.2、0.5 mmol·L-1，H3BO3、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O 、 Na2MoO4·2H2O 、 Na2EDTA 、FeSO4·7H2O 浓度分别为 3.33、0.5、0.51、0.13、0.17、2.1、2.1 μmol·L-1。气候条件为：昼夜温度25℃，光周期12 h/12 h，湿度80%～90%。茶苗首先用去离子水培养 3 d，然后改用 1/2营养液培养 1周，再转为全营养液进行培养21 d，培养过程中用气泵持续通气，待茶苗长出大量白色新根后，选取长势相同的茶苗（8～10片叶，20～25 cm）进行试验。
通过调整原有营养液中的 Al2(SO4)3·18H2O及KH2PO4的用量。试验设置3个铝浓度0、0.5、1 mmol·L-1，分别记为 Al0、Al1、Al2；
5个磷浓度 0、0.01、0.05、0.1、0.5 mmol·L-1、分别记为 P0、P1、P2、P3、P4，共 15组完全不重复的磷铝交互处理，其中P2Al1处理为正常营养液培养（CK），每组设有 3株重复。同时不同处理通过调整 K2SO4的用量维持钾离子的总浓度在 1 mmol·L-1，pH 统一调整为4.5。营养液每隔7 d更换 1次，处理21 d后取样进行形态及根系生长数据测定。
1.2 试验方法
1.2.1 根系数据测定
将茶苗的根部完整地剪下，将根系平铺于盛有水的托盘中，避免根系交叠。将托盘放入根系扫描仪（ScanMaker i800 Plus，Microtek）中进行扫描分析，根据根系扫描仪的颜色差异筛选功能，筛选获取处理后白色新根部分的各项数据。
将剪下的茶树根系放于 65℃烘箱中烘至足干。将烘干后的样品置于万分之一天平（AS160.R1，RADWAG）上称重并记录为干物质量，干物质量与CK（P2Al1）的干物质量之差记为干物质增加量。
1.2.2 磷、铝元素含量测定
将茶苗的全根、茎、老叶（第五六片叶）、嫩叶（第一二片叶）取下，65℃烘至足干，放入磨样机（Grinder-48，骋克）磨至粉末状。称取 0.1 g样品粉末放入完全干燥的消解管中，加入5 mL浓硝酸后放入微波消解炉中消解。消解程序为：0～20 min，升温至185℃；
20～40 min，保持 185℃。
将消解后的液体通过0.22 μm水系滤膜后注入离心管中，定容至 50 mL后于电感耦合等离子发射光谱仪（ICP-OES，optima 8000，PerkinElmer）上检测。并检测Al、P元素含量，检测波长分别为396.153 nm和213.617 nm[18]。
1.2.3 有机酸测定
将各组茶苗根部用纯水洗净，反复冲洗后擦净水分，放入盛有35 mL 0.02 mol·L-1CaCl2（pH 3.8）溶液的50 mL离心管中，保证根系完全浸没于液体内，培养并收集茶树 24 h的有机酸分泌量[19]。
收集液经过滤后放入液氮中速冻，再放入冷冻干燥机（ALPHA2-4/LSC，Christ）中冻干至粉末状。用2 mL超纯水将粉末重新溶解，通过0.45 μm水系滤膜后放入超高效液相色谱（UltiMATE 3000，Thermo）中检测。检测条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm×1.8 μm），流动相为 0.01 mol·L-1KH2PO4（含有 1%的甲醇，pH 2.10），流速0.25 mL·min-1，柱温 30℃，进样量 2 μL，检测波长 214 nm[19]。用外标法测定草酸、苹果酸、柠檬酸的含量。
1.3 数据分析
使用IBM SPSS Statistics 21软件对数据进行单因素及双因素方差分析，使用GraphPad Prism v8.0进行绘图。所有试验均重复3次，取平均值，P＜0.05表示存在显著差异。
2.1 不同磷铝处理对茶树根系形态的影响
处理 21 d后茶苗根系形态的变化如图1所示，铝元素的存在对新根生长较为关键，随着铝浓度升高，茶树的新根生长明显增强。在Al1水平下，高磷条件（P4）新根几乎全部褐化；
但当铝浓度提升到高铝（Al2）时，高磷条件（P4）下茶树能够维持白色新根的生长，说明高铝能缓解高磷对新根生长的抑制。
图1 不同磷铝处理下茶树的根系形态Fig. 1 Root morphology of tea plants under different phosphorus and aluminum treatments
2.2 不同磷铝处理对茶树根系生长的影响
由表1可知，在相同铝浓度（Al1、Al2）处理下，新根的根尖数、根长、平均直径及干物质增加量均在P1条件下达到最大值。P1Al1处理的根尖数、根长、平均直径，相较 CK（P2Al1）分别高出43.09%、35.28%和18.75%，干物质增加量较CK高出127.33 mg。在低磷高铝（P1Al2）处理下，根尖数、根长及平均直径均达到各处理中的最大值，比CK分别高出 134.61%、55.99%和 43.75%；
干物质增加量比CK高出158.23 mg。在同一磷水平下，供铝使新根的根尖数、根长、平均直径及干物质增加量显著增加，且随铝浓度的上升而增加。Al1处理下，P0、P1、P2及P3的新根长度较Al0处理分别增加了190.28倍、45.02倍、16.78倍及15.01倍，而Al2处理的新根长度较Al1处理增加了 80.29%、15.3%、13.79%及51.23%。双因素分析结果表明，磷、铝浓度对茶树的根尖数、根长、平均直径及干物质增加量均有极显著影响，但仅有根尖数及根长受到磷铝交互作用的影响。
表1 磷铝互作下茶树的各项根系指标Table 1 Theindex of rootsystem in tea plants under phosphorus and aluminum interaction
2.3 不同磷铝处理对茶树各部位磷、铝元素含量的影响
在培养期间，铝元素先在茶树根部积累，茶树根部铝含量远高于其他部位（图2）。一定范围内，磷浓度的增加使茶树根部铝含量显著增加，在P3时均达到最大值，而高磷（P4）显著抑制茶树根部铝的吸收。在 Al0、Al1和Al2处理下，P3处理时根部铝含量分别为 P0处理的3.07倍、5.40倍及4.23倍。供铝后（Al1、Al2），在一定磷浓度范围内，嫩叶中铝含量随磷浓度增加呈现上升趋势，但在高磷（P4）时显著下降。而无磷（P0）处理时的嫩叶铝含量却始终高于低磷（P1）处理，此变化趋势与根部基本保持一致。供铝后（Al1、Al2）茶树茎部铝含量也在P3处达到最大值，相较P0处理分别增加了4.19倍及1.73倍。当环境磷浓度达到高磷（P4）水平后，各部位铝元素含量均显著下降。在 Al0、Al1和 Al2处理下，与 P3相比，P4处理根部铝含量分别下降了50.49%、56.46%和61.33%，茎部分别下降了17.41%、80.34%和92.15%，老叶分别下降了27.28%、59.12%和44.77%，嫩叶分别下降了15.02%、48.71%和53.36%。双因素分析结果表明，磷、铝浓度以及磷铝互作对茶树根、茎、老叶和嫩叶中的铝含量均有极显著影响（P＜0.01）。
图2 不同磷铝处理下茶树根、茎、老叶、嫩叶中的铝含量Fig. 2 Al contents in roots, stems, mature leaves and shoot of tea plants under phosphorus and aluminum treatments
磷元素首先积累在茶树根部。由图3可知，除高磷（P4）处理外，在同一磷浓度下，高铝（Al2）显著促进了茶树根部磷元素的积累，在 P0、P1、P2和 P3处理下 Al2比 Al0处理分别增加了 479.11%、116.43%、76.72%和107.23%，比 Al1处理分别增加了 335.79%、84.71%、99.95%和 50.77%。在地上部分，尤其在茎和嫩叶中，磷充足条件下（P2、P3和P4）的磷含量总体随铝含量上升而下降；
在茶树嫩叶中，磷的积累被高铝（Al2）显著抑制，比 Al0处理分别下降了 31.19%、66.48%和87.94%；
而在磷缺乏条件下（P0及 P1），环境铝浓度对嫩叶中磷含量无明显影响。在茶树老叶中，仅在P3和P4处理下磷含量随铝浓度增加而下降。双因素分析结果表明，磷、铝浓度以及磷铝互作对茶树根、茎、老叶和嫩叶中的磷含量均有极显著影响（P＜0.01）。
图3 磷铝互作下不同磷铝处理下茶树根、茎、老叶、嫩叶中的磷含量Fig. 3 P contents in roots, stems, mature leaves and shoot of tea plants under phosphorus and aluminum treatments
2.4 不同磷铝处理对茶树分泌有机酸的影响
由图4可知，磷充足时（P2、P3和P4），供铝均能增加草酸、苹果酸及柠檬酸的分泌，这3种有机酸分泌量均随铝浓度的增加而升高。低磷（P1）或高铝（Al2）均能够显著诱导茶树草酸及苹果酸的分泌。相较CK而言，在同一铝浓度（Al1）下，P1处理使茶树草酸及苹果酸分泌量分别增加了 25.47%和127.38%；
在同一磷浓度（P2）下，Al2使草酸及苹果酸分泌量分别增加了 15.08%和94.05%。在低磷时供铝对苹果酸仍起促进作用，但对草酸分泌却呈抑制作用。低磷（P1）条件下，Al2相较 Al0而言，苹果酸分泌量增加了 98.55%，而草酸分泌量减少了 8.74%。对柠檬酸而言，除P0处理外，其分泌量随磷、铝浓度的上升而增加，并在P3Al2处理下达到最大值（141.04 μg·mL-1），但在环境磷浓度达到高磷（P4）水平后，柠檬酸分泌量下降。双因素分析结果表明，磷、铝浓度以及磷铝互作对茶树分泌的草酸、苹果酸及柠檬酸均有极显著影响（P＜0.01）。
图4 不同磷铝处理对有机酸分泌的影响Fig. 4 Effects on organic acid secretion under phosphorus and aluminum treatments
本研究表明，环境中的磷、铝浓度及其相互作用对茶树新根的根长、根尖数、各部位磷铝元素积累及有机酸分泌均存在极显著影响，表明磷铝互作在茶树的根系生长、有机酸分泌及磷铝吸收中起到重要作用。磷铝互作在其他植物中也有研究，Mora等[20]的研究结果表明，黑麦草对铝的耐受性是由于其有效的磷转运机制和强抗氧化活性，从而可以较大程度地减轻铝的毒性；
Liang等[21]发现大豆的苹果酸分泌受pH、Al和P等3个因素的共同调节。茶树自然条件下均生长在酸性土壤中，酸性土壤往往也伴随着低磷和高铝的环境，因此，磷铝互作与茶树耐酸和耐铝的生物学特性也可能存在潜在的相关性。
在茶树中，低磷高铝（P1Al2）对根系生长及苹果酸分泌作用效果相似。首先，低磷或高铝均能明显地促进茶树新根的生长，且协同作用明显。低磷条件下，茶树的根尖数及根长均达到各处理中的最大值，铝浓度的提升也使茶树的各项根系指标显著增加；
而在低磷高铝处理下，二者间效果叠加明显，茶树根部的各项生理指标均达所有处理的最大值。其次，低磷或高铝均能促进草酸及苹果酸的分泌，且低磷高铝能够协同促进苹果酸分泌。Balzergue等[22]发现，缺磷促进野生型拟南芥苹果酸的分泌，具有延缓初生根的生长及促进侧根发育的双重作用。结合本文研究结果来看，低磷能够促进茶树根部苹果酸的分泌及根系生长，但并未造成任何根系的生长抑制，可能是由于试验使用的扦插茶苗并无主根，低磷条件仅显示出促进了茶树不定根生长的情况。还有研究表明，苹果酸分泌也在茶树耐铝性中起到至关重要的作用[23]，因此茶树在低磷高铝共处理下协同促进根系发生与苹果酸的分泌存在一定相关性。
磷铝的相互作用还表现在两元素间相互促进吸收上，提高环境中的磷铝浓度能够显著促进另一元素在茶树根部的积累。有研究表明，在铝浓度小于1 mmol·L-1的条件下，增加铝浓度能够导致茶树根部的磷和钾等元素积累量增加[6]，而本研究表明磷浓度提升也能够促进茶树根部铝元素的积累，磷铝元素间存在协同促进吸收的作用。而磷铝互作对两种元素在嫩叶中的积累情况与根部不同。磷对铝的影响总体表现为供铝条件下磷能够促进铝元素在嫩叶中的积累，但在低磷条件下却会导致其积累量显著下降，因此铝向嫩叶的转运过程可能需要磷的参与。而在磷充足时，铝却会抑制磷在嫩叶中的积累。有研究发现，耐铝型荞麦相较铝敏感型荞麦而言，根系中的磷铝浓度显著升高，桑色素染色实验表明，根组织中的磷更能够将铝固定在细胞壁中[24]。而茶树作为耐铝植物，根部的磷铝元素间可能也有类似的情况，进而影响了茶树中磷的向上运输。
另外，由于茶树白色根与褐色根的比例与其健康程度呈正相关[25]。本研究中，常规铝（0.5 mmol·L-1）条件下，高磷（0.5 mmol·L-1）导致茶树白色新根生长受阻。Konishi等[26]的研究中也发现，过量磷（0.8 mmol·L-1）会造成茶树的白色新根褐化。本研究表明高铝能够在一定程度上缓解高磷条件下的白色新根褐化现象。有研究表明，油茶幼苗中添加磷能够缓解铝胁迫，并通过调节根部代谢如增加碳水化合物的合成等减少根中铝的积累[27]，在茶树中铝是否可以通过类似的调节机制来缓解高磷造成的新根生长抑制也有待进一步明确。
综上所述，本研究发现磷、铝浓度及其相互作用对茶树的根系生长、有机酸分泌及磷铝含量有极显著影响，低磷高铝对茶树根系生长及苹果酸分泌均具有协同作用；
另一方面，提高磷铝浓度能够互相促进茶树根系对另一元素的吸收，磷能促进铝在嫩叶中的积累，铝却抑制了磷向嫩叶中的转移。而磷铝元素间是否存在共同的转运途径以及磷铝互作的分子机制还有待进一步深入研究。