刘力源 ，李长青 ，姬广磊，卢龙飞 ，杨晓斌,，常丽荣
（1.威海长青海洋科技股份有限公司，山东 荣成 264300；
2.国家海产贝类工程技术研究中心，山东 荣成 264300；
3.威海市渔业技术推广站，山东 威海 264200；
4.威海青逸未来生物技术有限公司，山东 荣成 264300）
【研究意义】皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）是一种具有极高经济价值的水产养殖贝类，是我国鲍养殖中的优势品种［1］。为了提供更加高效、合理的外源营养促进稚鲍生长，人工配合饲料相关研究相继发展起来［2］。饲料的种类、营养是影响稚鲍生长速度和养殖产业产量的关键因素［3］。工厂化养殖条件下稚鲍主要取食人工饲料，但目前市场上的人工饲料质量参差不齐［4］。如何优化饲料配比是影响稚鲍生长、提高稚鲍产量的关键问题。【前人研究进展】目前在稚鲍人工饲料中添加促生长的物质主要有维生素、矿物质和微生物制剂等［4-6］，对微藻添加的研究相对较少。微藻是鲍发育过程中不可缺少的重要饵料，鲍从浮游幼体发育至稚鲍，主要以硅藻门藻类为饵料［7］。微藻作为饵料，对提高鲍育苗存活率具有重要意义。Gordon 等［8］研究发现，皱纹盘鲍摄食底栖硅藻后能显著提高其存活率。微藻富含蛋白、多糖、微量元素等，营养全面，在饲料中添加适量微藻具有促进生长、增强抗病能力等效果［7］。陈全震等［9］研究发现，饲料中添加螺旋藻可以促进皱纹盘鲍的生长，且效果优于单一的海带粉。陈晓燕［10］发现在养殖水中添加绿色巴夫藻能够促进稚鲍生长。朱丰等［11］研究认为在养殖水中添加新鲜微藻既能净化养殖水体的水质，又能促进鲍鱼生长。三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）隶属硅藻门，羽纹纲，褐指藻目，褐指藻科，褐指藻属［12］，易于养殖，含有丰富的蛋白质、多糖、维生素等营养物质［13］。目前，三角褐指藻在水产养殖方面仅作为饲料原料，较少涉及其对水产动物的影响探究［14］。海洋小球藻（Chlorella）隶属于绿藻门绿藻纲绿藻目小球藻科小球藻属，含有丰富的蛋白质，被广泛应用在饲料添加剂方面［15-16］。已有研究发现，用小球藻代替鱼粉饲喂鲫鱼能提高鲫鱼增重率、降低饵料系数、提高肝脏生脂酶活性［17］。饵料添加小球藻能够激活三疣梭子蟹的免疫活性［18］。小球藻能够促进南美白对虾生长，显著提高对虾血淋巴和肝胰腺中的抗氧化酶活性，提高南美白对虾的机体免疫能力［19-20］。日本蟳注射小球藻提取多糖后血清中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和溶菌酶活性显著提高，具有诱导免疫应答的作用［21］。但目前关于三角褐指藻和小球藻在稚鲍饵料添加方面的应用研究依然不足。
【研究切入点】近年来病害频发严重制约了鲍工厂化养殖的发展，其中细菌性病害占重要位置［22-25］。弧菌是最常见且危害最严重的细菌性病原之一［21,26-27］，目前主要采用抗生素进行防治，但并不能从根本上解决病害频发的问题。改善鲍人工饵料配比、提高自身免疫力是预防鲍病害的重要途径，而且由于微藻具有较高的营养价值，作为饵料添加剂对促进生长具有积极作用。【拟解决的关键问题】本研究以三角褐指藻和小球藻作为添加剂，比较不同添加量对皱纹盘鲍稚鲍生长存活的影响，探究在稚鲍饵料中添加三角褐指藻和小球藻的可行性，为皱纹盘鲍的养殖生产提供科学依据。
1.1 试验材料
供试的三角褐指藻、海水小球藻以及皱纹盘鲍均来自寻山集团有限公司，藻粉冷冻干燥过孔径0.150 mm 网筛后混入人工饵料中。本研究所用鲍饵料购自威海金牌生物科技有限公司，营养成分如下：粗蛋白≥30.0%、粗灰分≤30.0%、粗纤维≤12.0%、赖氨酸≥1.3%、总磷≥1.0%、水分≤12.0%、粗脂肪≥2.5%。
1.2 试验方法
1.2.1 养殖管理 养殖试验于2021 年5—8 月在寻山集团有限公司的养殖车间进行。鲍养殖在有附着基的白色塑料养殖槽（53 cm×38 cm×20 cm）内，使用沙滤流水养殖（水温20±2 ℃），暂养10 d 后开始试验。每个养殖槽内放置200 头稚鲍（壳长9.80±1.21 mm，体质量0.12±0.01 g）。试验周期为40 d，养殖期间每天16：00 投喂饲料，投饵量为稚鲍体质量的3%～5%，投饵后停水1 h，次日8：00 清理剩余饲料及粪便，并统计稚鲍死亡数量。
1.2.2 试验设计 三角褐指藻和小球藻分别设置3 个添加浓度（1%、3%、5%），每个处理设置3个平行，分别用PT1、PT3、PT5 代表人工饲料中添加1%、3%、5%三角褐指藻处理，用CH1、CH3、CH5 代表人工饲料中添加1%、3%、5%小球藻处理，每个平行200 头稚鲍；
对照稚鲍只饲喂人工饲料。
1.2.3 指标测定 于养殖10、20、30、40 d 时，分别从各处理随机选取10 头规格相近的稚鲍，检测内脏囊的细菌和弧菌数量。试验结束后各处理随机测量100 头稚鲍的壳长和体质量，并随机抽取10 头稚鲍进行全组织总抗氧化能力（T-AOC）和超氧化物歧化酶（SOD）活性测定，随机抽取10 头稚鲍进行消化腺α-淀粉酶（AMS）和纤维素酶（CL）活性测定。
采用游标卡尺和珠宝称测量稚鲍的壳长（精确度为0.01 mm）和体质量（精确度为0.01 g）。采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定稚鲍的T-AOC、SOD、AMS和CL，详细操作步骤见说明书。采用平板涂布法（PC 法）［28］进行细菌培养及菌落计数，采用2216E 培养基检测细菌数量、TCBS特异性培养基检测弧菌数量。取样时先用无菌海水冲洗内脏囊3 次，然后放入小型匀浆器中加入1 mL 生理盐水进行研磨，充分混匀并适当稀释，吸取1 mL 稀释后的菌液涂布培养基，每个处理至少3 次重复。25（±1）℃恒温培养48 h 后，统计2216E 和TCBS 平板上的菌落数量，即为细菌和弧菌数量。
1.3 指标计算
壳长日增长（DLG）、日增重（DWG）、壳长增长率（LGR）、增重率（WGR）、饵料系数（FCR）、死亡率计算公式如下：
式中，Li、Lt分别表示试验开始和结束时稚鲍的平均壳长，Wi、Wt分别表示试验开始和结束时稚鲍的平均体质量，T表示养殖天数。
1.4 数据分析
采用SPSS 24.0 对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncan进行组间多重比较，采用SigmaPlot 14.0 作图。
2.1 不同三角褐指藻和小球藻添加量对稚鲍生长参数的影响
经过40 d 养殖后，饲料中添加微藻的6 个处理稚鲍的生长参数见表1。由表1 可知，饲料中添加三角褐指藻和小球藻可促进稚鲍壳长的生长，各处理稚鲍的壳长均显著高于对照。三角褐指藻处理稚鲍的壳长均显著高于小球藻处理，以5%三角褐指藻处理壳长最大（16.38±2.49 mm）。三角褐指藻处理稚鲍的壳长日增长均显著高于对照和小球藻处理。饲料中添加三角褐指藻促进了稚鲍体质量的增长，三角褐指藻处理稚鲍的体质量均显著高于对照和小球藻处理，以5%三角褐指藻处理体质量最大（0.66±0.01 g）。三角褐指藻处理日增重均显著高于对照和小球藻处理。两种微藻的添加降低了稚鲍的死亡率，各处理死亡率均显著低于对照，以1%小球藻处理死亡率最低（2.00%±0.67%）。三角褐指藻处理壳长增长率和增重率均显著高于对照和小球藻处理，均以5%三角褐指藻处理最高。此外，三角褐指藻的添加显著降低稚鲍饵料利用率，其中以5%三角褐指藻处理的饵料系数最低（0.44）。
表1 不同微藻添加处理稚鲍的生长参数比较Table 1 Comparison of growth parameters of juvenile abalone treated with different microalgae
2.2 不同三角褐指藻和小球藻添加量对稚鲍抗氧化能力和消化酶活性的
由表2 可知，饲料中添加5%三角褐指藻可显著提高稚鲍的T-AOC、SOD 和AMS 活性，添加5%小球藻可显著提高稚鲍SOD 活性。各处理稚鲍的SOD 活性均高于对照，其中以5%小球藻处理SOD 活性最高（12.90±0.75 U/mg），5%三角褐指藻处理和5%小球藻处理SOD活性（12.90±0.75、12.99±0.42 U/mg）均显著高于对照。各处理T-AOC 活性均高于对照，其中以5%三角褐指藻处理T-AOC 活性最高（1.19±0.06 U/mg），显著高于对照。各处理α-淀粉酶活性均高于对照，其中以5%三角褐指藻处理α-淀粉酶活性最高（4.92±0.74 U/dL），显著高于对照。饲料中添加三角褐指藻和小球藻对稚鲍体内的纤维素酶活性未产生影响，各处理间差异不显著。
表2 不同微藻添加处理稚鲍的抗氧化能力和消化酶活性比较Table 2 Comparison of antioxidant capacity and digestive enzyme activities of juvenile abalone treated with different microalgae
2.3 不同三角褐指藻和小球藻添加量对稚鲍内脏囊中细菌和弧菌数量的影响
由图1 可知，饲料中添加5%三角褐指藻和5%小球藻对稚鲍内脏囊中细菌和弧菌具有一定的抑制作用。用添加微藻的饲料投喂稚鲍10 d和20 d 后，各处理稚鲍内脏囊中细菌和弧菌的数量低于对照，但差异不显著；
养殖30 d 后，5%三角褐指藻处理稚鲍内脏囊中弧菌和细菌数量（4 185±427、5 500±377 CFU/mL）显著低于对照；
养殖40 d 后，各处理内脏囊中细菌和弧菌的数量均低于对照，其中5%三角褐指藻和5%小球藻处理稚鲍内脏囊中弧菌和细菌数量均显著低于对照，5%小球藻处理稚鲍内脏囊中弧菌数量（4 463±459 CFU/mL）最低，5%三角褐指藻处理稚鲍内脏囊中细菌数量（5 025±240 CFU/mL）最低。
图1 不同时期不同微藻添加处理稚鲍内脏囊中细菌和弧菌的数量统计Fig.1 Quantitative statistics of visceral bacteria and vibrio in juvenile abalone treated with different microalgae at different stages
本研究采用添加三角褐指藻和小球藻藻粉的人工饲料饲喂皱纹盘鲍稚鲍，结果表明，藻粉添加可显著提高稚鲍的壳长、显著降低稚鲍死亡率，经过40 d 养殖后，部分处理T-AOC 和SOD 活性显著提高，表明三角褐指藻和小球藻藻粉的添加能促进稚鲍的生长、提高稚鲍的抗氧化能力。已有研究发现，微藻能促进鱼虾蟹和其他贝类等水产动物的生长、存活率和增强抗病性等［19,29-31］。楼宝［32］研究表明，在饲料中混入三角褐指藻能促进太平洋牡蛎面盘幼虫的生长等。本研究结果与已发表研究基本相符。
本研究的三角褐指藻添加处理稚鲍的生长优势明显，其中5%三角褐指藻处理各生长参数相对最优。这一结果可能与三角褐指藻的营养成分更优有关。三角褐指藻的总糖含量、蛋白质、部分游离氨基酸、叶绿素a 和类胡萝卜素含量均高于小球藻［33］。同时，三角褐指藻富含二十碳五烯酸（EPA），EPA 是鲍生长的必需脂肪酸，在鲍生长、繁殖中具有重要作用［34］。Laura 等［35］发现，在一定条件下，饲料中蛋白质的利用率与蛋白含量呈正相关。营养成分的差异可能是造成三角褐指藻和小球藻处理稚鲍生长差异的原因。此外，三角褐指藻和小球藻添加提高了稚鲍体内α-淀粉酶活性。α-淀粉酶已被证明与水生动物生长密切相关［36-38］。α-淀粉酶不仅可以影响水生动物对食物的消化吸收能力，而且其合成量影响水生动物的营养吸收［39］。本研究中，三角褐指藻添加处理稚鲍的α-淀粉酶活性平均值（4.69 U/dL）高于小球藻处理（3.88 U/dL）。结合生长参数发现，α-淀粉酶活性较高的处理各项生长参数均较高。
在饲料中添加三角褐指藻和小球藻可提高稚鲍T-AOC 和SOD 活性，降低稚鲍体内弧菌和细菌的数量，这一结果与前人对三角褐指藻和小球藻的抑菌效果研究［40-43］具有一致性。Kellam等［43］研究发现，三角褐指藻和小球藻的提取物对很多革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌具有抑制作用。席波等［42］研究表明，海水小球藻具有抑菌作用，且其提取物抗氧化活性较高。Pratt等［44］从小球藻中分离出具有抗菌作用的脂肪酸混合物。在投喂三角褐指藻和小球藻后，太平洋纺锤水蚤和南美白对虾的抗氧化酶活性明显提高［19,45］，表明三角褐指藻和小球藻一方面可能包含抑菌活性物质杀灭稚鲍体内的弧菌和细菌，另一方面可能通过提高免疫力间接降低其体内弧菌和细菌数量。鲍养殖环境和体内弧菌达到一定数量时，会引起鲍大量死亡［46-47］。本研究通过改善鲍饵料营养成分，降低稚鲍体内的细菌和弧菌数量，从而降低鲍病害发生的可能性，在一定程度上能够预防病害发生。此外，本研究采用冷冻干燥的方式进行藻粉预处理，很大程度上保留了微藻的有效成分［48］。关于三角褐指藻和小球藻对稚鲍体内弧菌、细菌的抑制机理还有待进一步深入研究。
本研究分析了饲料中添加不同比例三角褐指藻和小球藻藻粉对皱纹盘鲍稚鲍生长、抗氧化酶、消化酶活性以及内脏囊中细菌和弧菌数量的影响。结果显示，饲料中添加三角褐指藻和小球藻能显著提高稚鲍壳长，降低稚鲍死亡率，提高稚鲍T-AOC、SOD 和α-淀粉酶活性，但对纤维素酶活性影响不大。三角褐指藻藻粉促进稚鲍壳长生长效果优于小球藻藻粉。养殖40 d 后，添加5%三角褐指藻和添加5%小球藻可显著降低稚鲍内脏囊中弧菌和细菌的数量。添加5%三角褐指藻对促进稚鲍生长效果最优。
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