井豪宾，牛茵茵，肖祉婧，肖 晶，罗兴武，罗 凯，周毅峰，唐巧玉
（湖北民族大学a.生物科学与技术学院，b.硒食品营养与健康智能技术湖北省工程研究中心,c.生物资源保护与利用湖北省重点实验室,湖北 恩施 445000）
芝麻菜(Eruca sativaMill)，又称火箭生菜，十字花科芝麻菜属植物，可富集硒[1-2]。芝麻菜可食用且富含多种营养素，如铁、钾、维生素A 等[3-4]，可以辅助治疗胃病、肾病、抗坏血病、降肺气，也可用于抗癌[5-7]。芝麻菜中的一些活性提取物也具有利尿、降糖等功能[8-9]。因此，芝麻菜在功能性食品生产方面具有巨大潜力，对于维持人体健康有着重要的意义。
目前，对芝麻菜的研究主要针对其含有的硫代葡萄糖苷（GLS）[10]，包括分离提取、成分分析和活性研究。芝麻菜含有的GLS主要为4-甲硫基丁基硫苷（GER），它的水解产物为芝麻菜素（ERU）[11-12]，ERU可以调节抗氧化酶的表达水平[13]。李昕悦[10]通过比较热激、低温、超声3 种不同的处理后对芝麻菜种子及芽苗GLS 代谢的影响，得到了高效富集GLS 水解产物异硫氰酸酯（ITCs）的途径。谷友刚[14]对芝麻菜苷及其水解产物的提取条件进行优化并对其体外抗氧化性进行了探究，试验结果表明，芝麻菜苷及异硫氰酸酯具有较强的体外抗氧化能力。此外，RIHAN[15]还研究了芝麻菜中多酚和黄酮含量及其抗氧化活性。张耀等[16]对芝麻菜种子的蛋白提取分离条件进行了优化，并进行了蛋白抗菌实验，结果表明该蛋白对小白菜炭疽病菌等12 种真菌具有较强的抑制作用。ATNAN 等[17]研究了播种期和不同氮肥对火箭生菜种子油脂脂肪酸组成的影响，结果表明，有机肥、硝酸钙和硫酸铵这3 种氮肥对火箭生菜种子油脂脂肪酸组成有显著影响，不同的播种期也会对油脂脂肪酸成分含量造成影响。
综上所述，虽然目前对芝麻菜的一些功能性代谢产物研究比较多，但对芝麻菜种子油脂以及不同品种差异方面的研究比较欠缺。尤其现阶段随着对油脂的需求不断加大，出现供不应求，油料新作物开发研究也逐渐成为热点[18]。本研究通过比较3种不同品种的芝麻菜油脂组成、理化特性以及体外抗氧化活性，不仅拓宽了芝麻菜的综合利用方向，并为开发优质油料来源的芝麻菜品种提供参考。
1.1 材料与试剂
材料：3种芝麻菜种子购买于北京凤鸣雅世科技发展有限公司。
试剂：焦性没食子酸、三氯甲烷、无水硫酸钠、抗坏血酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、石油醚、异丙醇、硫代硫酸钠、冰乙酸、酚酞均购于国药集团化学试剂有限公司，分析纯；
碘化钾(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；
DPPH(分析纯)，合肥博美生物科技有限公司；
环己烷(分析纯)，天津市福晨化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
TU-1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、6890-5973GC-MS联用仪（美国Agilent公司）、080S超声波清洗机（深圳市华策科技有限公司）、HH-4孔电热恒温水浴锅（绍兴上虞祥达仪器制造有限公司）、GZX-9420 MBE 电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、H2050R 离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）、TissueLyser II高通量组织研磨仪（QIAGEN GMbH 公司）。
1.3 芝麻菜种子油脂提取
将种子干燥后经过高通量研磨仪研磨为粉末，过筛后采用索氏提取法[19]80℃提取3～5h，旋转蒸发除去石油醚，将得到的油脂避光低温保存备用。
式中：m2为圆底接收瓶和所提油脂的总质量(g)；
m1为烘干恒重的圆底接收瓶(g)；
m为称取的芝麻菜种子粉末的重量(g)。
1.4 芝麻菜种子理化特性分析
1.4.1 芝麻菜种子油脂理化特性 芝麻菜种子油脂过氧化值、碘值和酸价分别参照《GB5009.227-2016》《GB/T 5532-2008》和《GB5009.229-2016》测定。
1.4.2 芝麻菜种子油脂总酚含量测定 样品处理：将15mL甲醇分3次加到样品油中超声提取1.5h，离心，定容即得到待测样品。参考王未君等[20]采用Folin-Ciocalteu法。
1.4.3 芝麻菜种子油脂组成成分分析 样品甲酯化参考李可等[21]的方法。
色谱条件：进样口温度250℃，分流比：2∶1，氦气为载气，恒定流速1.2mL·min-1，升温程序：初始温度60℃，保持4min，以6℃·min-1升温至180℃，保持2min，以2℃·min-1升温至220℃，保持2min，以10℃·min-1升温至280℃，保持10min。
质谱条件：全扫描模式，扫描范围为35～440u，离子源为EI 源，电子能量70eV，四级杆：150℃，离子源温度为230℃。
1.5 芝麻菜种子油脂抗氧化活性的测定
参考何礼等[22-23]的方法测定对超氧阴离子自由基、DPPH清除率。
1.6 统计分析
每个试验重复3 次，结果用平均值±标准差来表示。使用统计软件SPSS 16.0 和Excel 2016 分析统计数据，用OriginPro 9.1、GraphPad Prism 8和SIMCA对数据进行图形处理分析。
2.1 3种芝麻菜种子油脂理化性质
酸价、碘值、过氧化值等可以综合评价油脂及所含游离脂肪酸，不饱和脂肪酸含量、油脂氧化程度等，由此来判断是否符合国家标准[24]，结果见表1。3 种芝麻菜种子的出油率都高于20%，其中小叶芝麻菜种子的出油率最高，但均低于菜籽出油率。花叶芝麻菜和小叶芝麻菜种子油脂的酸价和过氧化值都符合国家标准，火箭生菜种子油脂的酸价符合国家标准，过氧化值略高于国家标准；
火箭生菜，花叶芝麻菜以及小叶芝麻菜种子油脂中碘值分别为(151.67±7.09)，(99.67±1.97)，(43.23±3.76)g·100g-1。火箭生菜种子油脂碘值＞130g·100g-1，故为干性油，另外两种芝麻菜种子油脂碘值介于100～130g·100g-1，故与大多数常见的种子油脂一样为半干性油，同时也说明这3 种油脂的不饱和脂肪酸含量相对较高[25]；
酚类物质是一种活性物质，该3 种芝麻菜种子油脂中总酚含量大小依次为：小叶芝麻菜＞花叶芝麻菜＞火箭生菜，说明小叶芝麻菜生物活性相对较高，可利用价值高。
表1 3种芝麻菜种子油脂理化性质Table 1 Physicochemical properties of three kinds of Eruca sativa Mill seed oil
2.2 3种芝麻菜种子油脂成分分析
2.2.1 3种芝麻菜种子油脂成分鉴定结果 3种芝麻菜种子油脂通过GC-MS来鉴定成分，结果见表2、图1和图2。3 种芝麻菜种子油脂主要含有棕榈酸、亚油酸和油酸等11 种主要成分以及一些含量及其微小的脂肪酸，其中有3种饱和脂肪酸、6种不饱和脂肪酸和2种植物甾醇。由图2可知，各种油脂中脂肪酸成分相对含量存在差异，火箭生菜种子油脂的饱和脂肪酸相对含量为7.62%，不饱和脂肪酸相对含量为92.38%；
小叶芝麻菜种子油脂的饱和脂肪酸相对含量为11.24%，不饱和脂肪酸相对含量为88.76%；
花叶芝麻菜种子油脂的饱和脂肪酸相对含量为7.23%，不饱和脂肪酸相对含量为92.77%；
相比较，小叶芝麻菜种子油脂的饱和脂肪酸含量最高，花叶芝麻菜种子油脂的不饱和脂肪酸含量最高。3 种芝麻菜种子油脂均含有大量必需脂肪酸亚油酸和亚麻酸，其相对含量大小依次为：小叶芝麻菜（40.89%）＞花叶芝麻菜（23.49%）＞火箭生菜（22.41%）。油脂的这11 种主要成分在3个品种间均存在一定的变异，其中亚油酸、亚麻酸、油酸、硬脂酸、芥酸、cis-15-十四酸、菜油甾醇的含量变异属于高度变异，变异系数分别达到46.69%、44.97%、86.61%、57.93%、38.02%、58.55%、69.35%，由此可知，不同品种的芝麻菜种子油脂的成分含量不同。此外，小叶芝麻菜种子油脂中芥酸相对含量远低于其他两种油脂，且必需脂肪酸相对含量是其他两种油脂的2倍。由图3可知，该热图将3种芝麻菜分为两类，第一类为火箭生菜和花叶芝麻菜，第二类为小叶芝麻菜。这两类芝麻菜种子油脂脂肪酸含量有明显不同。小叶芝麻菜中棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸、二十碳烯酸、亚油酸和油酸与火箭生菜和花叶芝麻菜相比呈正相关，而二十二烷酸与小叶芝麻菜和火箭生菜相比呈正相关，于花叶芝麻菜比呈负相关。小叶芝麻菜中芥酸、谷甾醇和cis-15-十四酸与火箭生菜和花叶芝麻菜呈负相关，而火箭生菜的菜油甾醇于花叶芝麻菜和小叶芝麻菜比呈现正相关。综合来看，小叶芝麻菜种子油脂优于其他两种芝麻菜种子油脂，可作为进一步加工对象。
表2 3种芝麻菜种子油脂主要组成成分Table 2 Main components of three kinds of Eruca sativa Mill seed oils
图1 3种芝麻菜种子油脂总离子流图Figure 1 Total ion flow diagram of three kinds of Eruca sativa Mill seeds oils
图2 3种芝麻菜种子油脂脂肪酸主要组成成分质谱图及结构式（相对含量＞5%）Figure 2 Mass spectrum and structural formula of main components of fatty acids in three kinds of Eruca sativa Mill seed oils (relative content＞5%)
图3 3种芝麻菜种子油脂脂肪酸组成热图Figure 3 Thermogram of fatty acids in three kinds of Eruca sativa Mill seed oils
2.2.2 3种芝麻菜种子油脂成分比较
2.2.2.1 3种芝麻菜种子油脂成分偏相关性分析 3种芝麻菜种子油脂成分含量经SPSS软件偏相关性分析，火箭生菜与花叶芝麻菜种子油脂成分及含量存在极显著的正相关关系，偏相关系数为0.98（p＜0.01），表明油脂组成成分含量相似度很高；
火箭生菜与小叶芝麻菜种子油脂成分含量存在极显著的负相关关系，偏相关系数为-0.891（p＜0.01）表明两个品种的种子油脂组成成分含量有差异。
2.2.2.2 3种芝麻菜种子油脂成分PLS-Da分析 为了更好的分析比较3种不同品种种子的油脂成分含量差异，选用SIMCA 软件进行PLS-Da 分析，R2x、R2y、Q2分别为0.998，0.998，0.997，提取两个主成分时，可反映样品的主要99.89%信息（拟合总结图，图4a）。得分图样本点分散和差异，具有相同或相近性质的样本聚集在一起，而差异较明显的样本相互远离。由图4b 可知，在主成分1 上，火箭生菜与花叶芝麻菜种子油脂脂肪酸差异要弱于小叶芝麻菜与火箭生菜的差异性，这与上述3 种芝麻菜种子油脂成分偏相关性分析结果基本一致。各成分的载荷值代表该成分对该类物质反映程度的大小。由图4c 可知，棕榈酸、亚油酸、亚麻酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸、硬脂酸、谷甾醇、cis-15-十四酸在主成分1 上载荷值大，菜油甾醇与二十二烷酸在主成分2 上的载荷值大。由图4d PLS-DA 的VIP 值分析可知，二十二烷酸，菜油甾醇，油酸对三种芝麻菜种子油脂脂肪酸组成影响较大，VIP值大于1或接近1，这几种成分可作为区分3种芝麻菜种子油脂脂肪酸的主要特征物。
图4 3种芝麻菜种子油脂11种成分的拟合总结图(a)、PCA-DA得分图(b)、载荷图(c)、VIP值图(d)Figure 4 Fitting summary (a), Score (b) ,loading plots (c), VIP (d) based on the eleven components of three kinds of Eruca sativa Mill seed oil
2.3 3种芝麻菜种子油脂抗氧化性比较及分析
2.3.1 清除超氧阴离子能力比较 超氧根阴离子自由基（·O2-）是常见的活性氧自由基，具有氧化性强的特点，故对该自由基清除能力可以用来判断抗氧化剂在体外的抗氧化能力[26]。由图5 可知，小叶芝麻菜与火箭生菜种子油脂浓度达到1.25mg·mL-1与花叶芝麻菜种子油脂浓度2.5mg·mL-1时，清除率无显著性差异，3 种芝麻菜种子油脂的清除力相比，小叶芝麻菜种子油脂的清除能力较强，花叶芝麻菜种子油脂的清除力最弱。当3种油脂浓度为0.156～1.250mg·mL-1时，与对超氧阴离子清除率成线性关系，线性方程分别为：火箭生菜(y=37.135x+44.635,R2=0.949)，小叶芝麻菜(y=39.873x+44.762,R2=0.843),花叶芝麻菜(y=53.804x+12.276,R2=0.992)；
同样维生素C浓度与清除率的线性关系为:(y=23.249x+29.286，R2=0.870)。随着3种油脂的浓度上升，对超氧阴离子的清除率上升存在剂量效应关系，均弱于维生素C对超氧阴离子的清除力，但逐渐趋近维生素C，火箭生菜种子油脂的IC50为0.297mg·mL-1，小叶芝麻菜种子油脂的IC50为0.273mg·mL-1，花叶芝麻菜种子油脂的IC50为0.682mg·mL-1。
2.3.2 清除DPPH自由基能力比较 DPPH 是一种稳定的紫色自由基，可以被抗氧化剂猝灭，其在517nm 处的吸光度值降低。因此，DPPH 自由基清除能力也可以用来判断抗氧化剂在体外的抗氧化能力[27]。由图6 可知，火箭生菜种子油脂与小叶芝麻菜种子油脂对DPPH 自由基的清除率存在趋势交叉，且两者的清除率均高于花叶芝麻菜，3 种芝麻菜种子油脂浓度升高时，对DPPH 自由基的清除率逐渐增加，火箭生菜种子油脂的IC50为12.662mg·mL-1，小叶芝麻菜种子油脂的IC50为10.909mg·mL-1，花叶芝麻菜种子油脂的IC50为21.379mg·mL-1。在浓度为10mg·mL-1时，火箭生菜种子与小叶芝麻菜种子油脂对DPPH自由基的清除率与花叶芝麻菜种子油脂浓度为20mg·mL-1时，差异性不大。在浓度为2.5～20mg·mL-1范围内，3种芝麻菜种子油脂的浓度与对DPPH 自由基的清除率呈线性关系，线性方程分别为：火箭生菜（y=2.420x+18.937，R2=0.999)，小叶芝麻菜（y=3.291x+12.069，R2=0.993)，花叶芝麻菜（y=2.389x-1.127，R2=0.999)，而维生素C 的浓度与对DPPH 自由基的清除率基本不变且均高于95%。
图5 不同浓度的3种芝麻菜种子油脂以及维生素C对超氧阴离子的清除率Figure 5 Scavenging rate of superoxide anion by three kinds of Eruca sativa Mill seed oils and vitamin C with different concentrations
图6 不同浓度的3种芝麻菜种子油脂以及维生素C对DPPH自由基的清除率Figure 6 Scavenging rate of DPPH by three kinds of Eruca sativa Mill seed oils and vitamin C with different concentrations
不同品种的芝麻菜种子油脂之间理化特性、油脂组成成分存在差异。必需脂肪酸具有抗炎、抗癌[28-29]等多种，但必须通过外界获取才能达到机体的需要，进一步合成ω-3、ω-6体系等不饱和脂肪酸[30]，例如通过我们人体的自身代谢可产生具有保护心血管的EPA和DHA功能性脂肪酸[31]。本研究中3种油脂组成成分中的必需脂肪酸与世界卫生组织推荐的橄榄油必需脂肪酸含量在4.88%～14.9%相比均较高，火箭生菜种子油脂必需脂肪酸含量为22.41%，小叶芝麻菜种子油脂必需脂肪酸含量为40.89%，花叶芝麻菜种子油脂必需脂肪酸含量为23.49%。此外，火箭生菜种子油脂芥酸相对含量为45.47%，该结果与ATNAN 等[17]研究结果基本一致，稍低于花叶芝麻菜，而小叶芝麻菜种子油脂芥酸相对含量最低，为22.69%。因此，从油脂组成成分及理化性质看，3种油脂中小叶芝麻菜种子油脂品质较好，不但必需脂肪酸含量高，且芥酸含量最低，酸价、过氧化值等符合国家标准，油脂中还含有天然的抗氧化物甾醇。
体外抗氧化试验结果表明，3种油脂都具有一定的体外抗氧化能力且均存在剂量效应，相比较而言小叶芝麻菜种子的抗氧化活性较强。对于芝麻菜油脂抗氧化性和样品中所含有的活性物质-总酚之间的相关性需要进一步探索证实。
综上所述，相对于火箭生菜、花叶芝麻菜，小叶芝麻菜种子是更为优质的植物油料来源，且未来可为新型油料作物品种进行开发利用提供一定的理论基础。
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