余朝阁，隋心意，丁 勇，李 颖，齐蕴荣，刘佩钰
（1.沈阳农业大学园艺学院/设施园艺教育部重点实验室，沈阳 110161；
2.沈阳溢源生物科技有限公司，沈阳 110179；
3.抚顺市现代农业与扶贫开发促进中心，辽宁 抚顺 113006；
4.法库县农业农村局，辽宁 法库 110400）
番茄是设施栽培重要果菜，灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病和茄匍柄霉（Stemphylium solani）引起的灰叶斑病是设施栽培番茄两大重要病害，严重影响产量和品质。在番茄设施栽培生产中，普遍长期依赖化学农药防治作物病害，这不仅容易造成环境和产品的污染，还会导致病菌产生抗性，化学防治效果越来越难以令人满意[1]。因此，探索更加绿色环保和高效的病害防治方法已成为生产中急需解决的重要问题。
次氯酸可抑制人类、动物和植物上的多种病原物，次氯酸对病原物起抑制作用的有效氯包括HClO 分子和ClO-离子[2]，其中HClO 的杀菌能力显著强于ClO-[3]，在微酸性条件下次氯酸主要以HClO 分子形式存在[4-5]，杀菌效果好；
而HClO 见光后易于分解，其终产物主要为Cl－和O2，所以不污染环境和产品。由于次氯酸具有杀菌谱广、对环境和产品无污染、无残留等优点，所以，当前次氯酸已广泛应用于卫生、食品和物流等多个领域，并在植物病害的防治中也有部分研究和应用[6-7]。但是，关于次氯酸在防治植物病害中的适宜浓度、施用时期、间隔时间等使用技术等方面研究尚不系统。
本研究以微酸性次氯酸和L402番茄为试材，首先探明微酸性次氯酸对番茄植株无伤害作用的有效氯浓度范围；
然后探索对番茄灰霉病和灰叶斑病病原物（B.cinerea和S.solani）的生长和繁殖具较好地抑制作用，及对上述两种病害具有良好防治效果的次氯酸最佳有效氯浓度；
最后进一步探明最佳有效氯浓度的次氯酸防治番茄灰霉病和灰叶斑病的最适施用时期和间隔时间。研究结果筛选出既不伤害番茄叶片、又能较好地抑制病菌和防治病害的最适次氯酸有效氯浓度，并明确其防治两种病害的最佳施用时期和间隔时间，为应用次氯酸防治蔬菜病害、实现设施蔬菜安全优质生产提供技术支持。
1.1 材料
试验于2018年3月至2019年5月在沈阳农业大学园艺学院科研基地和设施园艺教育部重点实验室进行。供试番茄（Solanum lycopersicumL.）品种为L402，由辽宁省农业科学院培育获得。供试育苗和分苗所用基质为沈阳农业大学蔬菜无土育苗营养基质（专利号：ZL03133591.8）。
供试灰葡萄孢（B. cinereacinerea）和茄匍柄霉（S. solani）分别采集自田间番茄灰霉病病果和灰叶斑病病叶，经实验室分离、纯化，并经鉴定为上述病菌后于4℃冰箱中保存备用。
供试次氯酸为沈阳溢源生物科技有限公司生产，氧化还原电位996mV，有效氯浓度为100mg·L-1。
1.2 方法
用碘量法对次氯酸有效氯浓度（ACC）标定无误后，再用无菌水配制有效氯浓度为0，20，40，60，80，100mg·L-1的次氯酸水溶液，各浓度次氯酸水溶液pH值为6.2±0.1。分别用无菌水配制106cfu的灰葡萄孢和茄匍柄霉孢子悬液备用。
番茄采用50 孔穴盘育苗，5 叶1 心期定植于上口径和高度均为12cm 的塑料钵中，钵中所装基质高度为10cm。然后于白天温度25℃、相对湿度70%，夜间温度12℃、相对湿度90%，昼夜时长均为12h 的条件下培养。
1.2.1 次氯酸对番茄幼苗生长的影响 定植缓苗7d 后选株高和长势一致的秧苗，分别用有效氯浓度为0（对照），20，40，60，80，100mg·L-1的次氯酸喷雾番茄叶片的正反两面，均匀喷至叶片表面完全湿润而无水滴下流为止。每处理5株，3次重复。处理后14d测定番茄株高、茎粗、植株鲜重、地下部分和地上部分干重等生长指标，并计算全株干重、根冠比及壮苗指数，壮苗指数计算公式为：
1.2.2 次氯酸对番茄叶片的伤害作用 次氯酸处理24h后取各处理番茄叶片，用去离子水反复冲洗干净，并且注意不要对叶片造成机械损伤。晾干后用直径为5mm 的打孔器在各处理不同叶位的叶片上打取相同数量的叶圆片，然后测定各处理叶圆片的电导率，并计算相对电导率[8]。每处理5株，试验设3次重复。
1.2.3 次氯酸对病菌孢子萌发率的影响 分别用0（CK），20，40，60，80，100mg·L-1的次氯酸（1mL）均匀喷雾刚长满培养皿的灰葡萄孢和茄匍柄霉菌落，喷雾后立即盖上培养皿盖于25℃的恒温培养箱中培养，36，44，52，60，68h后，用10mL无菌水洗脱各处理培养皿中的分生孢子，振荡10min使孢子均匀悬浮，然后在显微镜下观测病菌孢子总数和萌发数量，计算孢子萌发率。每处理5个培养皿，试验设3次重复。
1.2.4 不同浓度对次氯酸防病效果的影响 定植7d 后选长势一致的秧苗分为2 组，每组5 簇，每簇5 株，对上述两组番茄秧苗分别喷施106cfu的灰葡萄孢和茄匍柄霉孢子悬液接种，晾干（约30min）后对每组各簇秧苗分别喷施0（对照），40，60，80，100mg·L-1次氯酸水溶液。孢子悬液和次氯酸溶液均喷雾至叶片均匀湿润而无水滴聚集，每处理设3次重复。接种后第7天调查各处理发病程度，并计算病情指数。
病害分级标准为：0 级，未发病；
1 级，病斑面积占叶片总面积的5%以下；
3 级，病斑面积占叶片总面积的6%～10%；
5级，病斑面积占叶片总面积的11%～25%；
7级，病斑面积占叶片总面积的26%～50%；
9级，病斑面积占叶片总面积的50%以上[9]。按照公式计算病情指数，病情指数计算公式为：
1.2.5 不同施用时间对次氯酸防病效果的影响 番茄秧苗定植缓苗7d后，分别在喷雾接种灰葡萄孢和茄匍柄霉前48，24，12，6，0h，和接种后6，12，24，48，72h喷施80mg·L-1的次氯酸，其中病菌接种与次氯酸同时处理为直接用80 mg·L-1的次氯酸配制106cfu 的灰葡萄孢或茄匍柄霉孢子悬液，以仅接种病菌不喷施次氯酸溶液的处理为对照。每处理5株，3次重复。接种后第7天调查发病程度并计算病情指数。
1.2.6 不同间隔时间对次氯酸防病效果的影响 番茄秧苗定植缓苗7d后，分别用106cfu的灰葡萄孢和茄匍柄霉孢子悬液喷雾接种，在接种后2，4，6d喷施80mg·L-1次氯酸，其中接种2d后喷施次氯酸的处理每隔2d喷施1次氯酸、接种4d后喷施次氯酸的处理则每隔4d喷施1次氯酸、接种6d后喷施次氯酸的处理则每隔6d重复喷施次氯酸，所有处理在接种后每2d如果无次氯酸处理时则喷施等量的无菌水，如此处理至接种后第12d，以接种后每2d喷施一次无菌水而不喷施次氯酸的处理为对照，对照和处理喷施次氯酸和蒸馏的次数见表1。每处理5株，3次重复。番茄秧苗培养条件、病菌接种、次氯酸处理、病害调查方法等同前，接种后第15天调查发病程度并计算病情指数。
表1 不同间隔时间喷施次氯酸处理的实验安排Table 1 Experiment arrangement of hypochlorous acid treatment at different interval time
1.3 数据处理方法
试验所得数据结果采用Excel软件进行统计，然后用SPSS 19软件进行差异显著性分析。
2.1 不同浓度次氯酸处理对番茄幼苗生长和叶片的影响
2.1.1 不同浓度次氯酸处理对番茄生长的影响 有效氯浓度为20～100mg·L-1时，次氯酸处理的番茄幼苗株高、茎粗、植株鲜重、植株干重、根冠比及壮苗指数等生长指标与未喷施对照差异并未达显著水平（表2），可见，20～100mg·L-1的次氯酸处理对番茄幼苗的正常生长影响不大。
表2 不同浓度有效氯处理后番茄植株的生长指标Table 2 Growth index of tomato plants treated with different concentrations of available chlorine
2.1.2 不同浓度次氯酸处理对番茄叶片的伤害作用由图1可知，次氯酸有效氯浓度为20～80mg·L-1的处理，番茄叶片相对电导率与对照差异不显著；
但当次氯酸有效氯浓度达100mg·L-1时，番茄叶片相对电导率比对照升高，差异达显著水平（图1）。可见，次氯酸有效氯浓度为20～80mg·L-1的处理对番茄叶片无明显伤害作用，次氯酸有效氯浓度为100mg·L-1时，对番茄叶片开始产生一定的伤害。
图1 不同浓度有效氯处理番茄叶片的相对电导率Figure 1 Relative electrical of tomato leaves treated with different concentrations of available chlorine
2.2 不同浓度次氯酸处理对2种病原物孢子萌发的影响
次氯酸对2 种病原物分生孢子萌发的抑制作用随着其浓度的增大而增强。20mg·L-1和40mg·L-1次氯酸对2种病原物分生孢子萌发均有一定的抑制作用，但其抑制率均较低，对灰葡萄孢分生孢子萌发的抑制率分别为5.0%和12.3%，对茄匍柄霉分生孢子萌发的抑制率分别为8.3%和17.0%。60～100mg·L-1次氯酸不仅显著抑制2种病原物的分生孢子萌发，且其抑制作用显著高于20mg·L-1和40mg·L-1次氯酸处理；
80mg·L-1和100mg·L-1次氯酸处理对2种病原物分生孢子萌发的抑制作用最强，二者对灰葡萄孢分生孢子萌发的抑制率分别达到了40.4%和46.2%，对茄匍柄霉分生孢子萌发的抑制率分别达到了41.6%和44.9%（图2）。
图2 不同浓度次氯酸处理对灰葡萄孢（A）和茄匍柄霉（B）孢子萌发率的影响Figure 2 Spore germination rate of B. cinerea (A) and S. solani (B) after treated with different concentrations available chlorine
2.3 次氯酸对番茄灰霉病和灰叶斑病的防治效果
2.3.1 不同浓度次氯酸对番茄灰霉病和灰叶斑病的防病效果 次氯酸处理可显著降低番茄灰霉病和灰叶斑病的病情指数，且随处理浓度增加病情指数降低。40mg·L-1次氯酸处理的灰霉病病情指数为55.0，比CK 降低38.6%，差异达到显著水平。80mg·L-1和100mg·L-1次氯酸处理病情指数最低，且二者十分接近，约为CK的1/3。40mg·L-1次氯酸处理的灰叶斑病病情指数为71.1，比CK降低14.6%，差异达到显著水平。60，80，100mg·L-1次氯酸处理灰叶斑病的病情指数在45.6～50.0 之间，显著低于40mg·L-1处理和CK，且三者间差异不显著（图3）。综上可知，80mg·L-1和100mg·L-1次氯酸对番茄灰霉病和灰叶斑均具有较高的防病效果，且两个浓度处理间防病效果之间无显著差异，所以后期以80mg·L-1次氯酸作为防治番茄灰霉病和灰叶斑的安全有效浓度。
2.3.2 不同时期施用次氯酸对番茄灰霉病和灰叶斑病的防病效果 接种前12h 以上施用次氯酸，对2 种病害几乎均无预防作用；
接种前6h至接种后48h施用次氯酸，对番茄灰霉病和灰叶斑病均具较好的预防效果，平均防效分别达56.8%和45.5%；
其中，接种前6h施用次氯酸对灰霉病和灰叶斑病防效分别为39.7%和34.1%，接种0～48h后喷施次氯酸，对灰霉病和灰叶斑病防效分别达51.2%～64.5%和40.7%～55.2%；
接种后72h喷施次氯酸，对两种病害的防效则显著降低，分别为20.7%和21.9%（图4）。可见，应用次氯酸防治番茄灰霉病和灰叶斑病，宜在番茄接种前6h至感病后48h以内进行及时处理。
图3 不同浓度次氯酸处理番茄灰霉病（A）和灰叶斑病（B）的病情指数Figure 3 Disease index of tomato gray mold (A) and gray leaf spot (B) after treated with different concentrations available chlorine
图4 不同时期施用次氯酸处理的番茄病情指数（A.灰霉病；
B.灰叶斑病）Figure 4 Disease indice of tomato after treated with hypochlorous acid at different periods(A.Gray mold;B.Gray leaf spot)
2.3.3 不同间隔时间施用次氯酸对番茄灰霉病和灰叶斑的防病效果 由图5可知，间隔2，4，6d喷施次氯酸的处理番茄灰霉病和灰叶斑病的病情指数均显著低于对照，但不同间隔时间处理间的病情指数差异较大，间隔2d的处理病情指数显著低于间隔6d的处理，间隔2d的处理和间隔4d的处理病情指数最低，且病情指数间无显著差异。可见，隔2～4d喷施次氯酸的处理对番茄灰霉病和灰叶斑病的预防有较好的抑制效果。
3.1 有效氯浓度对次氯酸抑菌和防病效果的影响
次氯酸具很强的杀菌效果，可有效杀灭多种禽畜和人体病原物[10-12]，所以被广泛应用于养殖和卫生等领域。次氯酸溶液中其杀菌作用主要为HClO 分子，其杀菌能力显著强于ClO-[3，13]，NaClO 溶液在偏酸性条件下（pH 值5～7）有效氯主要为HClO（90%以上），在碱性条件下ClO-所占比例增多，NaClO 溶液在pH 值5.7时对荧光假单胞菌（P.fluorescens）杀灭效果达98%，而在pH值7.6和pH值9.3时杀灭效果达仅为40%和1.3%[14-15]。
图5 不同间隔时间施用次氯酸处理的番茄病情指数（A.灰霉病；
B.灰叶斑病）Figure 5 Disease index of tomato after treated with hypochlorous acid at different interval days(A.Gray mold;B.Gray leaf spot)
关于次氯酸对植物病害防治的研究报道较少，但与之相关的电解水防治植物病害的研究相对较多，而酸性或微酸性电解水中有效氯主要为HClO，研究发现，酸性或微酸性电解水在有效氯浓度50mg·L-1和80mg·L-1时，对黄瓜白粉病、番茄白粉病和细菌性叶斑病的防治效果均可达到60%以上[2，4]。另有研究发现，有效氯浓度为100mg·L-1的次氯酸处理可提高黄瓜种子发芽率、利于黄瓜植株生长，而200mg·L-1效氯浓度的次氯酸则显著抑制黄瓜的生长[3]。
本试验结果表明，有效氯浓度为80mg·L-1和100mg·L-1的次氯酸对灰霉病和灰叶斑病的孢子萌发及其所致病害发生程度均具较强的抑制作用，而80mg·L-1的次氯酸既不抑制番茄植株生长，也不伤害番茄叶片，故80mg·L-1次氯酸处理是本研究较优的处理浓度。另一方面，各浓度的次氯酸对病原物的抑制作用与其对相应病害的防治效果表现基本一致，可见次氯酸的防病效果主要在于其对病原物的抑制作用。
3.2 次氯酸施用时期对其防病效果的影响
接种病菌孢子前6h至接种后48h施用次氯酸对番茄灰霉病和灰叶斑病均具较高的防病效果，更早或更晚施用次氯酸对病害的防效显著降低，甚至无效。次氯酸是一种强氧化剂，即使在常温下也会分解，而在高温或强光条件分解更快[16-17]。所以应用次氯酸防治上述病害需要把握好施用时期，施用过早可能由于次氯酸有效氯成分的分解而导致其抑菌效果迅速下降，施用过晚则可能病菌已在施用前已完成侵入和潜育，错过了最佳防治时期。
但是，由于本研究防病试验均为人工接种病原物，只有在接种处理时才将病原物人为施加到番茄上，所以提前喷施次氯酸的处理在接种之前不会影响到病原物。而实际生产中的病原物原本就存在于番茄所生长的环境中，只要对温室空间或番茄植株施用次氯酸处理，次氯酸所到之处不管病原物是否侵染植物均会对其产生影响。所以，实际生产中应用次氯酸在病害发生前进行预防，有可能比在植物发病后进行治疗效果更佳，关于次氯酸在番茄灰霉病和灰叶斑病自然发病中的作用还需进一步探索。
3.3 间隔时间对次氯酸防病效果的影响
植物病害防治的间隔时间是保证防治效果的重要因素之一，不同类型的病害或不同的药剂防治间隔时间不同。王红梅等[18]用氰烯菌酯悬浮剂防治小麦赤霉病发现，间隔4～10d 防治效果无显著差异；
乔志文等[19]用3种杀菌剂防治甜菜褐斑病发现，间隔7d和14d之间防治效果无显著差异，但通常显著高于间隔21d的防效。
本研究发现，番茄在接种灰霉病和灰叶斑病后每隔2～4d 喷施1 次次氯酸可有效抑制病害的发生，说明次氯酸有效防治番茄灰霉病和灰叶斑病的适宜间隔期为2～4d。但是，由于次氯酸防病主要在于其抑菌作用，应用次氯酸处理番茄植株或温室空间，只要次氯酸施用到的地方，无论病原物是否侵染番茄植株，都必然对其产生抑制作用，减轻这些病原物继续侵染植株，从而降低病害的发生程度，有可能间隔更长时期也可达到有效防病的效果。
3.4 次氯酸防病效果与番茄生长期的关系
灰霉病和灰叶斑病通常在番茄开花结果以后易于发生，特别是灰霉病，在番茄开花期花粉散落在叶片上，容易感染灰霉病[20]，这是因为番茄在开花结果期营养生长和生殖生长同时进行，导致植株抗病性与单纯营养生长相比有所下降。本研究用于防病试验的番茄植株为5叶1心期秧苗，并经过7d缓苗过程，该时期番茄秧苗处于营养生长后期并向花芽分化和开花期过渡阶段，其防病试验结果对番茄成株期灰霉病和灰叶斑病的防治具有同样参考价值；
同时，该阶段也是预防番茄多种病害发生的关键时期。
综上，在番茄灰霉病和灰叶斑病发生初期（2d 之内），每2～4d 使用1 次80mg·L-1有效氯浓度的微酸性次氯酸，不仅可有效预防上述两种病害，而且对番茄植株生长影响不大，对番茄叶片的伤害作用也较小。
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