李 晓，崔 超，王 源，于光辉*
（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；
2.胶州市农业农村局，山东青岛 266300）
里岔黑猪是胶州市里岔镇群众四千年选育逐步形成的具有特色的、极为罕见的优良地方猪种，是山东省的重要地方品种猪[1-2]，其毛色全黑，嘴筒长直，额有纵纹，具有耐粗饲、适应能力强、繁殖性能好等特色，椎骨数较其他猪种多1～2 节，是我国优良的地方品种，素有“南太湖，北里岔”之称[3]。
自上世纪以来，国内引种热潮高涨，大量国外猪种（长白、大白、杜洛克等）被引入，由于引入猪种具有瘦肉率高、生长周期短等特点[4]，对中国地方猪造成较大冲击，且部分地方猪种被盲目杂交或者被淘汰，导致血统不纯和群体规模锐减[5]，进行种质资源保护显得尤为重要。
以人工记录系谱的方式进行遗传结构分析，会因记录错误等原因，影响最终选种育种效果。通过分子水平进行群体遗传结构分析能够精准了解里岔黑猪群体现状，对地方猪种保护和利用具有重要意义[6]。随着保种技术的不断发展，通过SNP 芯片保种逐渐成为主流[7-8]。SNP 芯片作为现阶段重要的育种工具之一，被广泛应用于各个领域，其工作原理是通过芯片上固定的DNA序列与目的基因发生碱基互补配对，继而进行序列中的SNP 位点鉴定[9-11]。本实验利用SNP 芯片对茂华里岔黑猪良种场的在繁群体进行群体遗传结构和多样性分析，为里岔黑猪的选育及品种利用率提高等方面提供分子水平的参考依据。目前对里岔黑猪群体遗传结构的研究处于一个相对初级阶段，通过系统评价该群体有利于更好地保护该遗传资源。
1.1 实验材料 选择胶州市茂华里岔黑猪良种场共109头能繁里岔黑猪为研究对象，其中公猪13 头、母猪96 头，采集其耳组织置于含无水乙醇的离心管中带回实验室。
1.2 实验方法
1.2.1 DNA 提取与基因分型 采用酚-氯仿抽提法提取耳组织DNA，经紫外分光光度仪和凝胶电泳对DNA 质量进行检测，检测合格后的DNA 样本使用“中芯一号”芯片（北京康普森农业科技有限公司）进行SNP 基因分型，然后利用Plink（V1.90）软件[12]对基因型数据进行质控，保留常染色体上的位点，剔除最小等位基因频率小于0.01 的位点，质控后剩余39 644 个SNP 位点。
1.2.2 亲缘关系分析 将Plink（V1.90）软件质控后的数据进行主成分分析并计算个体间的亲缘关系[13]，采用Origin 2021 软件绘制第一主成分与第二主成分的二维图，分析品种内的群体结构，使用R 脚本构建热图。通过G 矩阵（V2）软件和RStudio 来计算亲缘关系值和热图。
1.2.3 群体结构分析 将基因型数据质控后的39 644 个SNP 位点进行群体遗传结构分析，通过MEGA7.0 软件[14]构建邻接法进化发育树（Neighbor-Joining tree,NJ tree）进行聚类分析，通过Plink（V1.90）软件进行群体结构分析。
1.2.4 ROH 分析 ROH 的长度和频率用来反应该群体的历史，使用Plink（V1.90）软件分析并统计每个样本中ROH 长度、分布和数目，利用公式计算ROH 片段总长度与常染色体基因总长度比值，得到基于ROH 的近交系数[15]。
其中，k 是个体的ROH 数目，L 是该物种的常染色体基因组的长度（猪V10.2 版本的基因组，常染色体长度约为2 450 462.292 kb）。
2.1 里岔黑猪遗传多样性分析 为了探究现存里岔黑猪群体的遗传结构，将测得的里岔黑猪芯片数据进行遗传多样性分析，发现胶州市茂华里岔黑猪良种场中里岔黑猪的有效群体含量为5.88，多态性遗传标记为0.825，期望杂合度为0.346 8，观察杂合度为0.334 9；
里岔黑猪群体的观察杂合度小于期望杂合度，可能是群体内近交造成的。
2.2 种群亲缘关系分析 本实验将109 个样本的39 644个SNP 进行主成分分析。由图1 可知，胶州市茂华里岔黑猪良种场所有能繁猪之间亲缘关系适中，多样性相对较高。但在第一主成分中，右侧的个体之间亲缘关系比较紧密，表明亲缘关系较近，可能存在近交。进而构建了该群体的G 矩阵（图2），也验证了主成分分析的结果，大部分样本处于中等亲缘关系范围，部分样本间亲缘关系较近，表明存在一定的近亲繁殖趋势，配种计划中应避免该样本相遇。
图1 里岔黑猪主成分分析结果
图2 里岔黑猪基于G 矩阵的基因组亲缘关系分析
2.3 里岔黑猪群体遗传结构分析 本实验所用里岔黑猪的血统信息均是由公猪得来，将13 头公猪结合G 矩阵和聚类分析。结果显示，现存公猪被分为8 个家系（图3），自上而下每个家系分别有1、1、1、2、1、2、2、3 头公猪，具体家系信息见表1。结合群体中的母猪和公猪的关系，除了8 个家系外，另有28 头母猪的血缘关系与任一公猪的亲缘关系均低，因此将其单独分类。
表1 里岔黑猪家系构建
图3 里岔黑猪能繁公猪样本聚类分析
2.4 近交程度分析 在109 头里岔黑猪中，共检测到4 250个ROH 片段，个体ROH 的总长度为0～1 008.33 Mb，平均ROH长度为343.56±18.251Mb，ROH长度在300～450Mb之间的个体数目最多，占39.45%（图5）。里岔黑猪个体含有的ROH 数量为0～70 个，平均为38.99±1.461 个，其中40～50 个ROH 的个体最多，占34.86%（图6）。通过对群体中各个体的ROH 统计，得到每个个体基于ROH 的近交系数值，由图7 可以得出，胶州市茂华里岔黑猪良种场近交系数主要集中在0.1～0.2 之间，当前整个保种群体的平均近交系数值为0.14。
图5 里岔黑猪ROH 长度的样本数
图6 里岔黑猪ROH 数量的样本数
图7 ROH 的近交系数分布情况
3.1 遗传多样性分析 里岔黑猪作为山东省重要的地方猪种之一，其系谱记录一直采用传统的人工记录而后统计汇总的方法，记录过程中可能会出现错写或者漏写等不确定因素，导致系谱错误或者无系谱的结果。基于SNP 芯片数据对里岔黑猪现存群体进行整体评估，将芯片数据构建的家系与记录系谱相对照，能够准确了解里岔黑猪现阶段的遗传多样性和保种现状。随着芯片技术的开发，Geneseek[16]、中芯一号、液相50 K[17]等的出现，降低了后续的育种成本，能够促进我国育种发展进度，从分子层面对其性状进行分析并指导育种。本研究所用里岔黑猪群体处于世代封闭模式，由于后期系谱丢失导致家系不明确，因此均作为同一世代进行测序。使用“中芯一号”芯片测得里岔黑猪有效群体含量为5.88，多态性遗传位点为0.825，这可能是群体内近交导致的结果，又由于里岔黑猪群体的期望杂合度小于观察杂合度，这进一步佐证了群体内近交的现状。本次测序结果较已报道的其他中国地方猪种（金华猪等）的有效群体含量略低[18]，且明显低于商品猪有效群体大小[19]；
刘彬等[20]利用“中芯一号”芯片对青峪猪群体进行分析，其中有效群体含量最高的为F1世代有12 头，最低为F3世代仅有3 头；
F1世代多态性遗传位点最高为0.659 2，F3世代最低为0.536，发现3 个重叠世代中多态性遗传位点与遗传多样性丰富度随世代均有下降趋势，这符合中国地方猪种现状。里岔黑猪杂合度的值低于之前报道的中国其他猪的杂合度[21]，这意味着遗传变异性相较于以前略有降低。根据基因芯片结果分析可得，可以在维持胶州市茂华里岔黑猪良种场现有家系不减少的情况下，制定合理的配种方案，减少近亲交配，维持其遗传多样性。
3.2 亲缘关系与遗传结构分析 为了分析茂华里岔黑猪良种场现存群体的遗传关系，通过NJ tree 并进行聚类分析[22]。整个里岔黑猪群体共109 头，可以分为8 个公猪的家系和1 个非公猪家系，共有3 个父系起源。目前里岔黑猪群体家系结构可以得出，不同家系公母猪数量和近交系数均不平衡，其中有4 个家系公猪数量最少仅有1 头，这与蔡春波等[23]利用Illumina CAUPorince 50 K 芯片测得的结果相似，马身猪被分成3 个家系，共20 头种公猪，其中部分母猪同时被分到了几个家系中并出现交叉现象，各家系公母猪数差异较大，家系结构不平衡；
王晨等[24]采用Illumina CAUPorince 50 K芯片也得出了相似结果，139 头蓝塘猪被划分为4 个公猪家系和1 个非公猪家系，平均每个家系4 头公猪，但最少的家系仅2 头公猪，家系结构不平衡。这可能与人工选种时仅按照体况健康、符合地方品种特征、性欲是否旺盛等留种标准有关，这也符合前期技术不发达时的选种现状。在后续保种工作中，各家系需要多加留种，使里岔黑猪群体中各家系血脉维持在一个相对稳定的数量，以防血脉丢失。通过SNP 芯片数据检测出的各公猪家系，可以通过冷冻精液的方式进行家系保护，有效降低保种支出。
3.3 近交程度分析 ROH 通常被用来估计基因组的近交系数[25]，ROH 长度和ROH 覆盖的基因组比例可以很好地反映近交系的年龄和来源，从而反映近交的水平。ROH 的长度与个体间亲缘成正比，ROH 片段越长其近交可能性越大，反之亦然[26]；
ROH 片段数目越多一般认为该群体存在一定的近亲繁殖[27]。在本实验检测的109 头里岔黑猪群体中，共检测到4 250 个ROH 片段，ROH 长度在500 Mb 以下占84.4%，最短ROH 为0 Mb，少部分个体ROH 长度达到900 Mb 以上，里岔黑猪个体含有的ROH 数量在40～50 个ROH 的个体最多，最少的仅有1 个ROH，平均近交系数值为0.14。相较于Liu 等[28]对梁山猪进行全基因组分析，得出凉山猪的大多数（80%）ROH 在100 Mb 以内，ROH 平均长度为63.24 Mb，群体的平均近交系数为0.026，里岔黑猪ROH 长度长于梁山猪，这可能是里岔黑猪在长期交配过程中，无意识的近交导致的结果，从两者的平均近交系数也能反映出近交的情况；
Xu 等[29]通过基因组还原和测序技术（GGRS）进行基因分型，202 头金华猪的ROH 数量大多数（77%）由1～5 Mb 的片段构成，ROH 长度小于10 Mb 的占总数的92%。古代与近代祖先对金华猪群体基因组产生了一定的影响，尽管群体内大部分个体近交系数较低，但仍有较高水平的近交系数，在后续留种过程中逐步淘汰该种个体，保证其遗传多样性；
Wang 等[30]利用Illumina 60 K 芯片将江西省的3个地方品种猪在全球猪群中进行比较，东乡花猪的平均ROH 最高达到140.5 Mb、萍乡两头乌平均ROH 最高达到38.7 Mb，稍高于野猪（20.6 Mb），玉山黑猪平均ROH 稍高为121.7 Mb。里岔黑猪相比较野猪和中国部分地方猪种（梁山猪、金华猪等）近交系数相对较大，可能是因为从小群体发展至如今规模，一直以本交作为配种方式，所以存在一定劣势，后期可以通过SNP 数据合理安排配种计划，必要时可以改变配种方式，采用人工授精[31]等方式保证群体结构的稳定。
3.4 制定适合的育种方案 通过分析里岔黑猪NJ 数据，从8 个家系中各选1 头性状优良的种公猪，将96 头能繁母猪随机分为8 组，每组12 头。参考Windig 等[32]通过计算机模拟的几种保种方案，按照轮换交配的方式，制定适合于胶州市茂华里岔黑猪良种场的育种方案：第1 轮按照家系A 与第1 组母猪交配；
家系B 与第2 组母猪交配；
家系C 与第3 组母猪交配……家系H 与第8 组母猪交配。第2 轮按照家系A 与第2 组母猪交配；
家系B 与第3 组母猪交配；
家系C 与第4 组母猪交配……家系H 与第1 组母猪交配。第3 轮家系A 与第3 组母猪交配；
家系B 与第4 组母猪交配；
家系C 与第5 组母猪交配……家系H 与第2 组母猪交配，按照步骤依次轮转交配，能有效减缓近交系数增长速度。
本研究从分子水平基于里岔黑猪群体进行分析，发现里岔黑猪群体遗传多样性较丰富；
各家系中个体数相对较少且差异明显，需注意家系内留种；
为防止胶州市茂华里岔黑猪良种场群体内近交系数增长过快，需制定合理配种方案，必要时可以从其他保种场引入新鲜血液。