何亚鹏，李小龙，刘鑫，张树林，杜迎春，李博，魏凯，邹强军
（北京市水生野生动植物救护中心，北京 102100）
迟钝爱德华菌（Edwardsiella tarda,Et）是属于肠杆菌科，爱德华菌属的一种革兰阴性短杆菌，目前是水产养殖中有极大危害的一种病原菌[1]。多种淡、海水鱼类如鲫（Carassius auratus）、鲤（Cyprinus carpio）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、鲮（Cirrhinus molitorella）、短须裂腹鱼（Schizothorax wangchiachii）、鳗鲡（Anguilla japonica）、大鳞大马哈鱼（Oncorhynchus tshawytscha）、斑点叉尾（Ictalurus punctatus）、黑鲈（Micropterus salmoides）、鲽（Pleuronichthys cornutus）、牙鲆（Paralichthys olivac-eus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）等，两栖类动物中华鳖（Trionyx Sinensis）、大鲵（Andrias davidianus）、蝾螈（Salamandrae）等均可被感染发病。在鲆鲽鱼类的规模养殖中，该菌危害尤甚，给养殖户造成巨大损失，并且危害食品安全[2-4]。迟钝爱德华菌还可感染人类，在一定条件下引发人的胃肠炎，严重可致败血症，从尿液、粪便、血液中能分离到该菌[5]。迟钝爱德华菌基因组中存在多个毒力基因，相关研究表明，orfA、citC、fimA、gadB、katB、mukF和ssrB基因与致病性有关，只出现在有毒株中。fimA基因长度为534 bp，编码的菌毛分子质量为19.3 ku，在细菌感染中起黏附和入侵宿主作用，还有红细胞凝集的作用[6]。
目前检测该细菌的方法主要有细菌分离培养、生化鉴定、ELISA、胶体金免疫层析法及PCR等方法。这些方法一般费时费力，对试验平台要求很高，需要一些专业的设备，并且有的方法难以区分其致病性。环介导的等温扩增技术是近年来兴起的一种恒温条件下快速检测病原核酸的分子生物学方法，反应迅速，操作相对简单，不需很专业的仪器设备，恒温即可完成扩增，一般在水浴锅中就可满足反应条件，同时具有较高的灵敏度和特异性，特别适用于大量样品的快速诊断。本研究针对致病性迟钝爱德华菌的毒力基因fimA，设计3对特异性引物，优化反应条件，建立了迟钝爱德华菌LAMP检测方法，对快速诊断、防控迟钝爱德华菌病及维护公共卫生安全具有重要意义。
1.1 材料
Bst 2.0 DNA聚合酶及Buffer缓冲液购自NEB（北京）有限公司；
核酸染料SYBR Green I购自Solarbio公司；
迟钝爱德华菌、杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和豚鼠气单胞菌等菌株由北京市水生野生动植物救护中心实验室分离保存[7-8]。
1.2 LAMP引物设计与合成
通过对比，选取致病性迟钝爱德华菌的fimA基因作为目标基因，使用LAMP引物设计软件Primer Explorer V5设计LAMP引物，比较筛选，最终的序列见表1，合成引物，稀释为20 μmol/L。
表1 fimA基因LAMP引物序列
1.3 细菌DNA的提取
按照操作步骤分别提取迟钝爱德华菌、杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和豚鼠气单胞菌等菌株的基因组DNA，测定其浓度，置于-80℃超低温冰箱备用。
1.4 LAMP检测方法的建立及优化
建立25 μL的LAMP扩增反应体系。体系包含6条引物：F3-fimA和B3-fimA各0.5 μL，FIP-fimA和BIP-fimA各2 μL，LF-fimA和LB-fimA各1 μL；
dNTP（10 nmol/L）2.5 μL；
10×ThermoPol反应缓冲液[20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L KCl，10 mmol/L（NH4）2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.1% Triton X-100）]2.5 μL；
8 U Bst 2.0 DNA聚合酶；
1 μL迟钝爱德华菌的DNA样品（21.6 mg/L），ddH2O补齐至25 μL，混匀。相同的体系5个样品分别在61，63，65，67，69℃恒温水浴锅反应35 min，随后都转移至80℃水浴5 min进行灭活。结束反应后，在反应管中各加入1 μL稀释100倍的核酸染料SYBR Green I，混匀，观察反应液颜色变化，得出结果。另取反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳条带，选取最佳反应温度。
1.5 LAMP特异性试验
分别取迟钝爱德华菌、杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和豚鼠气单胞菌基因组DNA各1 μL为模板，其他条件不变，构建LAMP反应体系进行检测，同时以ddH2O为模板，相同体系和条件反应作为阴性对照，观察检测结果，判定该方法的特异性。
1.6 LAMP灵敏性试验
取迟钝爱德华菌的DNA（21.6 mg/L）10倍梯度稀释，分别以稀释成浓度为2.16，2.16×10-1，2.16×10－2，2.16×10－3，2.16×10-4，2.16×10-5，2.16×10-6mg/L的DNA各取1 μL，分别构建LAMP体系进行反应，检测该方法的灵敏性。
1.7 重复性试验
利用建立的LAMP检测方法，在不同时间，对同一阳性迟钝爱德华菌的DNA样品进行检测，以验证本方法的稳定性。
1.8 LAMP的临床检测
将建立的LAMP检测方法进行临床应用。采集疑似患病的鲤和虹鳟样品10份，分别采集其肝和肠道混合，研磨取上清，提取DNA，利用本试验建立的迟钝爱德华菌的方法进行检测；
同时参考相关文献，利用之前已经建立的检测迟钝爱德华菌的PCR方法，对这些样品进行检测[9]，引物PF为5′-TCAACCTGGAGCAGTGTGAG-3′，PR为5′-GCGCCT－GCAGGTTAAATATC-3′，目的片段长240 bp，电泳。观察结果，对比分析该方法在临床检测上的适用性。
2.1 LAMP反应温度的优化
结果显示，在61、63和65℃时，扩增产物加入核酸染料后变为荧光绿色[图1（a）]，电泳出现阳性的阶梯状电泳条带[图1（b）]；
当扩增温度为67、69℃时，反应结果为阴性；
直接显色的结果与凝胶电泳结果相符，多次重复试验结果均一致，表明在温度为61，63，65℃时均可以进行反应。本方法选取63℃为最佳扩增温度。
图1 LAMP反应条件优化结果
2.2 LAMP特异性试验
迟钝爱德华菌、杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和豚鼠气单胞菌都是水生动物常见的病原菌，感染鱼类后的一些临床症状如皮肤溃疡、腹水、肠炎等有相似性，本试验利用4种细菌和ddH2O做对照，检测该LAMP检测的特异性。结果显示，迟钝爱德华菌样品进行LAMP扩增后，直接显色和电泳结果为阳性；
其他4种细菌及ddH2O结果为阴性[图2（a）（b）]，说明该检测方法特异性较好。
图2 LAMP特异性检测结果
2.3 LAMP灵敏性试验
测得提取的迟钝爱德华菌的DNA浓度为21.6 mg/L，依次进行10倍梯度稀释，分别以2.16，2.16×10-1，2.16×10-2，2.16×10-3，2.16×10-4，2.16×10-5，2.16×10-6mg/L的迟钝爱德华菌的DNA为模板，构建反应体系，进行反应，观察该检测方法的灵敏性。结果显示，当DNA浓度为2.16×10-5~2.16 mg/L时，LAMP反应后变色，电泳结果为阳性，当2.16×10-6mg/L，LAMP反应结果为阴性[图3（a）（b）]，说明该检测方法可以检测浓度不低于2.16×10-5mg/L的迟钝爱德华菌的DNA，具有较高的灵敏度。
图3 LAMP灵敏性试验检测结果
2.4 重复性试验
相同的试验条件下进行3次重复性试验，结果均一致，证明该检测方法重复性和稳定性良好。
2.5 LAMP临床应用检测结果
利用本试验建立的迟钝爱德华菌的LAMP方法和之前已建立的迟钝爱德华菌的PCR检测方法对比试验结果表明，LAMP反应后，2号、8号样品变色，电泳结果为阳性的阶梯状条带，样品中检出迟钝爱德华菌，其他样品检测结果为阴性[图4（a）（b）]，未检测出迟钝爱德华菌。PCR和LAMP检测方法的结果一致，2号、8号样品出现240 bp的条带[图4（c）]。
图4 临床样品检测结果
从1962年Hoshina首次报道鳗鲡感染迟钝爱德华菌开始，该菌的感染范围不断扩大，鱼类宿主已达20余种，一些两栖类、鸟类、哺乳类动物亦可感染，地域范围也不断扩展，呈全球性分布。感染爱德华菌的病鱼一般表现为食欲不振甚至绝食，行动迟缓，腹部肿胀，剖开一般可见腹水，部分病鱼的体表各个部位有不同程度的出血现象[10]。由迟钝爱德华菌所引起的各种鱼类感染症种类繁多，统称为“鱼类的爱德华菌病”。该病菌对人类健康也有重大威胁，从事打捞的渔民、养殖人员等容易感染此菌，一般引起胃肠炎，也能导致肠道以外的一些感染，如脑膜炎、心内膜炎、皮肤感染、骨髓炎等，病情严重时，可能引起败血症，产生致命威胁。因此，有效地检测该菌及防控相应的感染，具有重要的意义。
环介导等温扩增技术，利用特异性识别靶序列的3对引物及一种在恒温条件下具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，可以在恒温条件进行目的片段的指数级扩增。条件简单，易于操作，结果也比较可靠，适合进行病原的核酸检测，多种检测水生动物病原的LAMP方法已经被建立[11]。本试验建立的致病性迟钝爱德华菌的LAMP检测方法，特异性好，对迟钝爱德华菌的核酸检测的灵敏性可达2.16×10-5mg/L，优于已报道的PCR检测方法的灵敏度达2个数量级[12]。该方法对试验仪器要求低、操作简便、耗时短、比较可靠，适合水生动物传染病检测的要求，但LAMP技术也有自身的局限性，首先是LAMP对于试验设计要求较高，引物设计和条件的摸索需要严谨，这样才能保证后续使用时的便捷高效。因此应特别关注反应的特异性，合理设计引物，规范操作，消除假阳性因素。
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