陈玉静 丁一倩 周明兵
（浙江农林大学，省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，竹子研究院，浙江 杭州 311300）
植物细胞中，除可编码蛋白的信使RNA（mRNA）以外，还存在着诸多类型的非编码RNA，包含核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）、反式作用tasiRNA、小干扰RNA（siRNA）、小核仁RNA（snoRNA）、小核RNA（snRNA）长链非编码RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）和环状RNA（circRNA）等［1］。其中circRNA广泛参与胁迫响应，逐渐成为近几年的研究热点。
circRNA 第一次被发现是在高等植物的类病毒中［2-3］。随着高通量测序和生物信息学的发展，在古菌、秀丽线虫、小鼠、大鼠和人类中同样发现了大量环状RNA［4-5］。虽然circRNA 在植物中被首次鉴定［6］，但植物circRNA 的研究相对落后。近几年circRNA 在单子叶植物水稻［7］、小麦［8］和玉米［9］，双子叶植物拟南芥［10］、茶树［11］、沙棘［12］、苎麻［13］等植物中相继被发现。为了大规模鉴定circRNA，很多预测circRNA 的软件被开发出来，如CIRI2［14］、CIRI-full［15］、CircAST［16］、find_circ［17］、CircRNAwrap［18］等均为用于预测动物circRNA 的软件；
CircPlant［19］和PCirc［20］是特异性针对植物circRNA 的鉴定软件，能更准确、有效地识别植物中的circRNA。
目前已有研究表明，circRNA 在受到非生物胁迫时会发生差异表达。例如，拟南芥在弱光和强光胁迫后，circRNA发生明显的差异表达［1］；
在盐胁迫下，对黄瓜进行circRNA 分析，发现有差异表达［21］；
在高温胁迫下，circRNA 在番茄叶片中的表达量也有所上升或者下降［22］。非生物胁迫不仅会使circRNA 表达量发生改变，而且会影响前体mRNA 的选择性剪接，进而影响circRNA的形成［16］。
有证据表明circRNA是细胞不同RNA互作的网络重要组成部分。所有包含miRNA 结合位点的RNA 转录本可以通过竞争共享与miRNA 的相互作用［6］。与miRNA 竞争性结合，从而调控mRNA 的非编码RNA称为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）［23-25］。第一个ceRNA 是在拟南芥中发现的，该研究表明非编码RNA IPS1 可以通过与miR399 结合来影响PHO2的表达水平［26］。近期同样有研究表明circRNA 是ceRNAs的重要成员，通过miRNA 调节靶基因的表达。例如，有报道发现CircFN1可以通过CircFN1-miR-19a/b-3p-ATF2网络调控氧化应激诱导的滋养细胞凋亡以及增殖和迁移［27］。
毛竹在我国分布极其广泛，是集众多功能于一体的笋材两用竹种。目前，关于circRNA 参与毛竹生长发育的研究已经取得了一定进展。转录组测序发现，毛竹的开花植株比3 周龄幼苗、1 岁植株、明年开花植株和小花中存在数量更多的circRNA；
circRNA 的侧边内含子在长末端重复（long terminal repeat，LTR）反转座子中存在高甲基化和富集，说明circRNA 参与了毛竹开花的调控［28］。另有研究也发现，circRNA 可以通过与miRNA 和mRNA 的调控网络相互作用，参与毛竹竹笋的生长［29］。
吴佳军［30］前期构建了低温、高温、紫外、高盐等4种胁迫全转录组数据库。为研究毛竹响应胁迫机制，本研究利用上述4种胁迫全转录组数据库，筛选并鉴定在紫外（ultar-violet，UV）胁迫和高温下都差异表达的1个circRNA，命名为PhcircRNA1；
分析与PhcircRNA1协同表达的miRNA 和mRNA，构建circRNA - miRNA - mRNA调控网络，研究PhcircRNA1参与毛竹胁迫响应和根尖中生长发育调控的机制，以期为circRNA 调控毛竹的生长发育提供新思路。
1.1 试验材料
毛竹（Phyllostachys edulis）种子均采自广西桂林市灵川县同一株母竹。剥好的种子用反渗透水浸泡3 d后，再用10%次氯酸钠浸泡消毒，之后在垫上滤纸的培养皿中催芽培养后，再移栽到盆里，培养基质为泥炭：蛭石：珍珠岩，体积比例为3∶1∶1。
1.2 材料处理
毛竹长至五叶一心时期，将其暗处理3 d后进行胁迫处理。胁迫处理条件：1）42 ℃高温胁迫（4、6、8 h）［31］；
2）紫外胁迫（2、4、6 h）［32］；
对照（CK）培养条件为正常光照下28 ℃培养，取五叶一心叶片进行液氮速冻，存于-80 ℃冰箱。毛竹种子催芽处理后，将其水培培养。根据毛竹根生长的发育规律，待毛竹主根长至0.5～1 cm时，以水培15、30、35 d 的0.5 mm 左右根尖作为材料［33-35］，进行液氮速冻后于-80 ℃冰箱中储存备用。提取RNA时，每管使用6株毛竹的根尖。所有样品均设置3次生物学重复。
1.3 毛竹总RNA提取和cDNA合成
采用天根生化有限公司RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒提取RNA。RNA 反转录为cDNA 的试剂盒分为两种：Hifair®III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（gDNA digester plus）试剂盒［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］，和miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （by stem-loop）试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）；
反转录miRNA 所用茎环引物：5＇-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT GGATACGACGTGCCC-3＇，同时加入5.8S rRNA 的下游引物一起进行反转录。最后将得到的cDNA 保存在-20 ℃冰箱备用。
1.4 毛竹circRNA的筛选与鉴定
使用find_circ［17］软件对毛竹中circRNA 进行预测。首先从全转录组测序数据［30］的毛竹基因组中不能比对上的序列片段（reads）两端各取20 bp 作为锚点，将锚点作为reads 与基因组进行比对，当锚点比对位置与转录本中位置相反时，延长锚点read 直至找到circRNA 接合位置。选择在两端序列存在GT/AT 剪接信号，且片段数量（read count）大于等于2 的circRNA作为候选circRNA。利用浙江农林大学周明兵课题组（本课题组）前期研究得到的4 种胁迫全转录组数据库［30］，在该毛竹circRNA数据库中，以|log2 fold change|≥1且P＜0.05 作为筛选标准，筛选了1 个在紫外胁迫和高温胁迫下都差异表达的circRNA，命名为PhcircRNA1。利用植物小RNA 标靶分析软件psRNATarget（v2）（参数设置：最大期待值设置为5，互补性评分长度设置为19），分析得到PhcircRNA1的靶miRNA，该miRNA 与miRNA156 成熟序列［35］只相差1 个碱基，命名为PhmiR156。用TargetFinder［36］软件对Ph-miR156 进行靶基因预测，再在4 种胁迫全转录组数据库［30］中筛选出在紫外和高温胁迫下均差异表达的靶基因。
1.5 PhcircRNA1的成环和稳定性分析
设计引物前，先将5＇端和3＇端各自截取300 bp 序列，将3＇端截取的序列置于5＇端头部，形成一个新序列，用Primer 5.0 软件设计跨环化位点的发散引物（divergent primers）。
核糖核酸酶R（ribonuclease R，RNase R）是一种来源于大肠杆菌RNR 超家族的3＇→5＇核糖核酸外切酶，可从3＇→5＇方向将RNA 逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R可消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环形RNA［37］。将0.5 μL RNase R加入到2.5 μg毛竹RNA 中，37 ℃孵育30 min，把消化后的RNA 反转录为cDNA，用发散引物鉴定PhcircRNA1稳定性。
1.6 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)
PhcircRNA1和靶基因用普通反转录得到的cDNA作为模板，NTB作为内参，用Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix 试剂盒［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］进行PhcircRNA1和靶基因定量分析，通过Primer 5.0 软件设计qRT-PCR 引物（表1）。miRNA（PhmiR156）用miRNA 反转录试剂盒得到的cDNA 作为模板，以5.8S rRNA 作为内参，利用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）进行miRNA 定量分析。利用qRT-PCR 和2-△△Ct法分析PhcircRNA1、miRNA（Ph-miR156）和mRNA 的相对表达量。反应体系共20 μL：10 μL SYBR，0.5 μL 上游引物，0.5 μL 下游引物，1 μL cDNA，8 μL ddH2O。反应程序：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性10 s，60 ℃复性30 s，共40个循环。
表1 qRT-PCR引物序列Table 1 The sequence of the primers for qRT-PCR
2.1 PhcircRNA1的鉴定
使用find_circ［35］软件对毛竹中circRNA 预测后，结合4种胁迫全转录组数据库［30］，以|log2 fold change|≥1且P＜0.05作为筛选标准，筛选出在紫外胁迫和高温胁迫下都差异表达的1 个circRNA，其前体序列位于moso_draft_hic_scaffold_16 染 色 体 （80360941～0361611、80385866～80388941），经过反向剪接形成了由6 个外显子和4 个内含子组成的外显子-内含子型circRNA（exon-intron circular RNA，EIciRNA），并命名为PhcircRNA1（图1-A）。利用植物小RNA 标靶分析软件psRNATarget鉴定出与PhcircRNA1有17个互补配对碱基的1 个靶miRNA（图1-B），该miRNA 与水稻miRNA156 相差1 个碱基（图1-C），命名为PhmiR156。用TargetFinder［36］软件对Ph-miR156 进行靶基因预测后，筛选出紫外胁迫和高温胁迫（42 ℃）下均差异表达的4 个靶基因（图1-D）：PH02Gene02319（Glutamate Receptor - Like Gene 3.1，GLR3.1），PH02Gene31266（Ubiquitin-conjugating enzyme，UBC28），PH02Gene28384（Cyclic Nucleotide-Gated Channel 8，CNGC8）和PH02Gene33036（Vernalization Insensitive 3-Like 1，VIL1）（图2）。
图1 PhcircRNA1的鉴定Fig.1 Identification of PhcircRNA1
图2 PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA在不同胁迫处理下的表达分析Fig.2 Expression analysis of PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA in different stress treatments
2.2 PhcircRNA1成环验证
在RNase R 消化处理后反转录得到cDNA，分别用内参NTB的定量引物和PhcircRNA1的发散引物进行PCR。结果显示，RNase R 消化组中的NTB条带明显变淡，表明RNase R 对total RNA 中线性RNA 具有消化作用，而PhcircRNA1基本上没有变化（图3-A）。将PhcircRNA1的PCR 扩增片段进行胶回收，测序比对结果证实了PhcircRNA1首尾相连的特征（图3-B），进一步证明PhcircRNA1符合环状RNA特征。
图3 PhcircRNA1成环验证Fig.3 Verification of PhcircRNA1 cyclization
2.3 PhcircRNA1在紫外胁迫下的表达模式
为研究PhcircRNA1在紫外胁迫下的表达模式，对不同时间紫外处理下的PhcircRNA1进行差异表达分析。结果表明，在紫外胁迫（2、4、6 h）时，PhcircRNA1表达量呈先下降后上升趋势，而4 个靶基因PH02Gene 02319（GLR3.1）、PH02Gene31266（UBC28）、PH02Gene2 8384（CNGC8）和PH02Gene33036（VIL1）表达量也先降低后升高，与PhcircRNA1表达趋势一致，而Ph-miR156表达量呈先上升后下降趋势，与PhcircRNA1和靶基因表达趋势相反（图4）。表明PhcircRNA1表达量下降会引起Ph-miR156 表达量升高，进一步降低4 个靶基因的表达量。说明在紫外胁迫下，PhcircRNA1-PhmiR156-mRNA调控通路符合竞争性内源RNA机制。
图4 PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA在紫外胁迫下的表达模式Fig.4 Expression patterns of PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA under ultraviolet stress
2.4 PhcircRNA1在高温胁迫下的表达模式
为研究PhcircRNA1在高温胁迫下的表达模式，对不同时间高温胁迫下的PhcircRNA1进行差异表达分析（图5）。结果发现，在高温胁迫（4、6、8 h）下PhcircRNA1表达量随着高温胁迫时间延长而降低，Ph-miR156 表达量呈升高趋势，而4 个靶基因PH02Gene02319（GLR3.1）、PH02Gene31266（UBC28）、PH02Gene28384（CNGC8）和PH02Gene33036（VIL1）表达量呈降低趋势，与PhcircRNA1表达趋势一致。结合上文PhcircRNA1在紫外胁迫下的变化，进一步证实了PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA调控通路的真实性。
图5 PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA在高温胁迫下的表达模式Fig.5 Expression patterns of PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA under high temperature stress
2.5 PhcircRNA1在毛竹根尖中的表达模式
取毛竹生长不同时期（0、15、30、35 d）的根尖作为研究对象（图6-A）。通过qRT-PCR 分析GLR3.1表达模式的变化，在0～15 d 时，PhcircRNA1和GLR3.1表达量下降，15～30 d时表达量上升，30～35 d时表达量再次下降，Ph-miR156表达趋势与PhcircRNA1和GLR3.1表达趋势相反（图6-B），说明PhcircRNA1可能通过调控Ph-miR156和GLR3.1参与毛竹根尖的生长发育。
图6 PhcircRNA1在毛竹四个生长时期根尖的表达模式Fig.6 Expression patterns of PhcircRNA1 in moso bamboo root tip at four growth stages
circRNA 是一种具有多种生物学功能的新型调控RNA，在植物中大量分布，通常来自外显子、内含子以及基因间区域。本研究根据本课题组前期研究得到的转录组数据，筛选并鉴定到PhcircRNA1以及其调控的miRNA 和4 个靶基因，PhcircRNA1是由位于moso_draft_hic_scaffold_16 染 色 体（80360941～0361611、80385866～80388941）的前体序列反向剪接形成的EIciRNA。在植物中，circRNA 的反向剪接位点侧翼序列中重复元件或反向互补区域的富集较少［38］，具有更多的选择性剪接位点以及非规范反向剪接位点［39］，在不同物种之间的保守性较低［40］。circRNA 作为ceRNAs，在miRNA 介导的转录后基因表达调控中发挥重要作用。如在拟南芥中，circRNAs 可能通过螯合影响与过氧化氢、植物激素和热应激有关基因的表达［41］；
在番茄中，circRNA45和circRNA47可能通过调节miRNA-mRNA 表达水平，在番茄抗性中起正调节作用，最终增强植物抗性［42］。但是circRNA 的研究主要集中在人类和动物疾病中［43］，而在植物中circRNA 的研究相对较少，大量circRNA 及其功能需要进一步挖掘。
PhcircRNA1调控的miR156 是调控植物开花的重要因子［44］，4 个靶基因中PH02Gene31266（UBC28）、PH02Gene28384（CNGC8）和PH02Gene33036（VIL1）均与植物开花相关［45-47］，其中UBC28是泛素结合酶基因，可以编码一种新的RING finger 蛋白，在泛素蛋白酶体系统中参与了蛋白质降解的调控，影响烟草的生长发育［48］。在拟南芥中，UBC突变体在长日照和短日照条件下均表现出早花表型［45］。CNGC8是环状核苷酸化通道，有研究报道花粉管特异性环状核苷酸化通道（CNGC8）与钙调蛋白2 共同构成一个分子开关，该开关可根据细胞钙水平控制钙通道的开启或关闭，从而控制开花植物的花粉管生长［46］。VIL1是春化相关基因，短日照时通过染色质修饰可以抑制FLOWER LOUS M（FLM），从而促进拟南芥开花［47］。GLR3.1在水稻中可以编码一种典型的谷氨酸受体样蛋白，与根顶端分生组织（root apical meristem，RAM）中的细胞增殖和细胞存活有关，在水稻中GLR3.1的缺失会抑制根尖的伸长［49］。本研究结果表明，在紫外线胁迫和高温胁迫下，PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA 在毛竹中均有差异表达，且PhcircRNA1与4 个靶基因表达趋势一致，与Ph-miR156 表达趋势相反。在高温胁迫下，PhmiR156 表达量上升，与在拟南芥中的研究结果一致［50-51］。4个靶基因的qRT-PCR结果与全转录组测序结果相同，在高温胁迫与紫外胁迫下表达量都呈现下降趋势，说明PhcircRNA1可能通过调控Ph-miR156 来调控靶基因的表达，参与毛竹的开花和生长发育。本研究展示了PhcircRNA1- Ph-miR156-mRNA 调控通路，后期将通过双荧光素酶试验进一步验证该调控网络的准确性。
已有研究表明，毛竹根生长速率在15 d 时最快，30 d 变缓慢直至35 d 时趋于停滞［33］。本研究调查了PhcircRNA1在不同生长速率毛竹根尖的表达模式，结果表明PhcircRNA1和GLR3.1表达趋势一致，与PhmiR156 表达趋势相反。毛竹生长至15 d 时，PhmiR156 表达量最高，毛竹根长生长速率最高，说明PhcircRNA1通过Ph-miR156调控GLR3.1的表达，可能影响毛竹根的生长发育。但是PhcircRNA1如何通过调节Ph-miR156从而影响靶基因表达的具体机制仍有待进一步探究。
本研究鉴定了1 个参与毛竹高温胁迫和紫外胁迫的非编码调控RNA-PhcircRNA1，构建了PhcircRNA1-Ph-miR156-mRNA 调控网络，推测PhcircRNA1可能作为Ph-miR156 海绵，调控GLR3.1的表达，在毛竹根尖的生长发育过程中发挥重要的调控作用。
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