Sin-QuEChERS,快速滤技术结合超高效液相串联质谱仪对猪肉中甲硝唑和恩诺沙星的测定

解迎双，白兴斌，寇宗红，张 欢，王 波

（1. 兰州海关技术中心，甘肃 兰州 730010；
2. 白银市食品检验检测中心，甘肃 兰州 730999）

我国人口众多，畜牧产业发达，既是畜产品的消费大国也是畜产品的出口大国。兽药在畜产业的发展中可谓居功甚伟，增加了养殖动物对各种疾病的抵抗力，减少了养殖动物的伤亡，提高了养殖户的经济效益。但近年来，兽药也暴露出一些违用、滥用的问题。甲硝唑是最早在1962 年被发现的第一代硝基咪唑类药物，属人畜共用型药物，在畜牧产业中，主要用于治疗原虫感染、厌氧菌感染等疾病[1]。恩诺沙星是一种常见的喹诺酮类抗生素，其抗菌活性较强。甲硝唑和恩诺沙星作为硝基咪唑类药物和喹诺酮类药物的典型性代表，广泛应用于畜牧、水产等养殖业中[2-3]。近年来，由于滥用抗生素类药物及违法使用的现象，导致含有抗生素残留的肉类在加工进入人体内，抗生素类药物在体中积聚会引起中毒反应、血小板降低、溶血性贫血等各种不良反应，严重危害了人类身体健康[4-5]。许多发达国家和组织为了保证动物肉类的健康均先后制定颁布了关于肉类中抗生素的残留限量的一系列标准。我国在标准《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量GB 31650—2019》中，明确了对猪肉中甲硝唑不得检出，恩诺沙星可在限量范围内使用，其限量值为100 μg/kg。

国内外关于猪肉中甲硝唑和恩诺沙星的检测方法，主要包括酶联免疫法[6-7]，液相色谱-串联质谱法[8-9]，超高效液相色谱-串联质谱法[10-12]以及液相色谱-飞行时间质谱法[13-16]。其中，超高效液相色谱-串联质谱法凭借超快速的扫描，精准的定量、定性等优势已成为猪肉中甲硝唑和恩诺沙星的常用检测方法。目前，关于猪肉中甲硝唑和恩诺沙星的检测难点主要有：①固相萃取的检测步骤较为繁琐，难以实现快速高通量的检测。②QuEChERS[17]方法未实现自动化、净化效果差、方法的灵敏度不足。试验建立的Sin-QuEChERS 快速滤技术结合超高效液相串联质谱仪对猪肉中甲硝唑和恩诺沙星的测定的方法，Sin-QuEChERS 快速滤技术，是一种基于QuEChERS 法发展起来的一种净化方法，可用以去除基质样品中的共提取物。该方法净化材料除采用了QuEChERS 法的常用净化材料N -丙基乙二胺和十八烷基硅烷键合硅胶外，还使用了多壁碳纳米管。能够有效提高填料的净化速度。与传统QuEChERS法相比，该方法无需吸附剂的称量和提取液的转移，萃取净化一步完成，大大缩短了净化时间，提高了前处理速率和效率。

1.1 仪器与试剂

1.1.1 设备设施

ACQUITY UPLC I-Class 型高效液相色谱仪、Quattro Premier XE 型三重四极杆液质联用仪；
BSA822 型电子天平；
BCE224i-1CCN 型电子天平；
BC-1000 型涡旋振荡器；
3K30 型低温冷冻高速离心机；
N-EVAP112 型氮吹仪；
ZABN2000 型氮气发生器；
移液枪。

1.1.2 试剂耗材

甲硝唑标准品（98%）、恩诺沙星标准品（98%）迪马科技提供；
甲醇为色谱纯、乙腈为色谱纯、乙酸乙酯为色谱纯、正己烷为色谱纯、甲酸为色谱纯，德国默克公司提供；
无水硫酸镁、氯化钠，国药提供；
LM806-FC-724 型Sin-QuEChERS 快速滤过柱，北京绿绵提供；
MCX 固相萃取柱，美国沃特世公司提供；
石墨化碳黑、PSA，美国安捷伦公司提供；
C18色谱柱，美国安捷伦公司提供；
0.22 μm 微孔滤膜，天津艾杰尔公司提供；
超纯水由实验室纯水仪制备，其他试剂均为分析纯。

1.1.3 样品来源

猪肉样品购自于大型超市。

1.2 标准溶液配制

（1） 单标准储备溶液。质量浓度100 mg/L，分别准确称取恩诺沙星标准物质0.010 2 g，甲硝唑标准物质0.010 2 g，用甲醇定容至100 mL 容量瓶内，配制成质量浓度为100 mg/L 的单标准储备溶液，置于-20 ℃冰箱中保存。

（2） 混合标准储备溶液。质量浓度1 000 μg/L，分别移取2 甲硝唑和恩诺沙星单标准储备溶液1.00 mL，用甲醇定容至100 mL 容量瓶中，配置成质量浓度为1 000 μg/L 的混合标准储备溶液。

（3） 混合标准工作溶液。质量浓度100 μg/L，分别移取甲硝唑和恩诺沙星的混合标准储备溶液1.00 mL，用甲醇定容至100 mL 容量瓶中，配置成质量浓度为100 μg/L 的混合标准工作溶液。

1.3 样品前处理

准确称取粉碎后的猪肉样品5.00 g（精确至±0.01 g）于50 mL 离心管中，加入5 mL 后水涡旋3 min，再加入质量分数为1%乙酸的乙腈溶液（体积比）10 mL，涡旋3 min，于常温超声15 min。加入6 g无水硫酸镁（预先烘干），1.5 g 氯化钠（预先烘干）后立刻剧烈涡旋3 min，并以转速13 000 r/min 离心5 min。取上清液置于带有刻度的15 mL 离心管中，于45 ℃氮气吹至1 mL，将浓缩液加载至LM806-FC-724 型Sin-QuEChERS 快速滤过净化柱内，在该柱下方，连接1 个0.22 μm 的有机相滤膜。下压柱塞杆，使浓缩液通过快速过滤柱和有机相滤膜后，收集于一进样小瓶内，供UPLC-MS/MS 测定。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

ZORBAXEclipsePlus C18色谱柱（100 mm，2.1 mm，1.8 μm）；
柱温30 ℃；
进样体积2 μL；
流量0.3 mL/min；
流动相A 为1%甲酸溶液，B 为乙腈。

梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件

ESI 离子源；
毛细管电压4 000 V；
干燥气温度300 ℃；
干燥气流量10 L/min；
雾化器压力14 kPa；
正离子源，多反应监测（MRM） 模式。

质谱参数见表2。

表2 质谱参数

2.1 色谱条件

通过对质量浓度为10 μg/L 的甲硝唑和恩诺沙星的混合标准溶液进行测定，对仪器工作条件进行优化。选择多反应监测（MRM） 模式，采用1 个母离子和与之相对应的2 个子离子组成的离子对的方式，对恩诺沙星和甲硝唑进行了二次定性，增加了定性的准确性。以10 μg/L 单标准溶液分别重复进样12次，按照国际对离子丰度比最大偏差允许值的范围要求，计算甲硝唑和恩诺沙星的2 个定性离子之间的丰度比平均值作为该化合物的抗干扰指标。结果表明，甲硝唑和恩诺沙星的离子丰度比均在要求范围内。

甲硝唑和恩诺沙星总离子色谱图见图1，甲硝唑10 μg/L 与恩诺沙星10 μg/L 标准品色谱图（MRM）见图2。

图1 甲硝唑和恩诺沙星总离子色谱图

图2 甲硝唑10 μg/L 与恩诺沙星10 μg/L 标准品色谱图（MRM）

2.2 提取溶剂的选择

分别以1%乙酸乙腈（体积比）、乙腈溶液、乙酸乙酯溶液作为提取溶剂提取样品中的甲硝唑和恩诺沙星。试验结果表明，乙酸乙酯作为提取溶剂时，对样品中的脂肪和蛋白质等干扰物质有较大的溶解度，在后续的浓缩试验过程中易产生油状物，净化过程中易造成快速滤过柱的堵塞且上机检测过程中有较强的基质效应。乙腈作为提取溶剂，在提取过程中对蛋白有较好的沉淀作用，可以部分去除肉类样品中的蛋白质，降低了基质对恩诺沙星和甲硝唑的吸附并提高其回收率[18-20]，但采用乙腈作为提取溶剂时，甲硝唑的回收率较低为60%~80%。使用含1%乙酸的乙腈溶液为提取剂时，甲硝唑的回收率明显提高，回收率可达96%以上。因此，选择含1%乙酸的乙腈溶液作为猪肉中甲硝唑和恩诺杀星的提取溶剂。

2.3 净化条件的选择

分别选择MCX 固相萃取柱、QuEChERS、Sin-QuEChERS 快速滤技术对其进行净化处理。通过回收率、操作步骤的难易程度、试剂消耗量、操作速度等4 个因素对净化方法进行评价。

净化条件比对表见表3。

表3 净化条件比对表

由表3 可知，3 种净化方法的回收率均能达到方法学考查的要求，但是Sin-QuEChERS 快速滤技术操作步骤简便、试剂消耗量小更适合于本实验的要求。

2.4 标准曲线和检出限

将混合标准储备溶液（1.2 标准溶液配制） 逐级稀释，配制恩诺沙星和甲硝唑的质量浓度分别为0.50，1.00，10.00，100.00，200.00，500.00 μg/L 6个梯度浓度的混合标准工作溶液。将该标准溶液梯度系列按照1.4 中的仪器条件进行测定，以甲硝唑和恩诺沙星的质量浓度作为曲线的横坐标，以筛选出的甲硝唑和恩诺沙星的定量离子的峰面积作为曲线的纵坐标，分别绘制恩诺沙星和甲硝唑的标准曲线。

将混合标准溶液（1.2 标准溶液配制1 000 μg/L）稀释至0.50，1.50，5.0 μg/L 质量浓度后依次添加至猪肉样品中，按照1.3-1.4 的试验方法进行检测后，以3 倍信噪比（3 S/N） 计算检出限。

线性参数和检出限见表4。

表4 线性参数和检出限

由表4 可知，甲硝唑和恩诺沙星的线性范围较宽，检出限满足测定要求。

2.5 精密度试验

精密度用以表示测定方法的再现性，以保证测定结果准确[21-23]。按照1.3-1.4 的试验方法对同一样品进行测定（n=7）。

精密度试验结果（n=7） 见表5。

表5 精密度试验结果（n=7）

由表5 可知，甲硝唑和恩诺沙星测定值的RSD为3.1%~3.6%，说明该方法在对甲硝唑和恩诺沙星进行检测时的精密度较好，符合方法学要求。

2.6 回收试验

按照（1.3-1.4） 试验方法对空白猪肉样品进行加标回收试验，加标的质量浓度为2.00，6.00，20.0 μg/L，每个浓度值平均测定6 次，以6 次平均值计算回收率。

回收试验结果见表6。

表6 回收试验结果

由表6 可知，甲硝唑和恩诺沙星的回收率为96.0%~107%，可满足该方法对猪肉中甲硝唑和恩诺沙星的检测要求。

2.7 实际样品分析

对兰州市的8 家大型超市中所售的猪肉样品采用试验优选的方法，分别抽取20 批次进行测定，结果表明，甲硝唑和恩诺沙星化合物均未检出。

针对猪肉样品基质复杂的特点，采用1%乙酸乙腈直接提取，经快速滤过柱净化，结合UPLCMS/MS，建立了猪肉中甲硝唑和恩诺沙星的快速定性定量分析的方法，并运用所建立的方法检测20 批次猪肉样品。与传统的样品预处理方法相比较，该方法具有操作简单、快速高效、数据准确的优点，为日常大量茶叶样品中兽药残留的快速筛查提供了一条新的途径。

推荐访问:质谱仪 高效 串联