裴徐梨，冯鹏宇，唐 征，李亚梅，焦 鹏，荆赞革，
（1.昆明学院 农学与生命科学学院，云南 昆明 650214；
2.温州科技职业学院 农业与生物技术学院，浙江 温州 325006）
长 链 非 编 码RNA（Long non-coding RNAs，LncRNAs）是一类长度超过200 bp 的转录本[1]，其在调控下游基因表达、增强mRNA 稳定性和调节蛋白质活性等生理活动中发挥着重要作用[2-3]。目前，已在 水 稻（Oryza sativaL.）[4]、拟 南 芥（Arabidopsis thalianaL.）[5]、白菜（Brassica pekinensisL.）[6]、黄瓜（Cucumis sativusL.）[3]和木本植物如樱桃（Cerasus pseudocerasusL.）[7]、葡萄（Vitis viniferaL.）[1]等物种中鉴定出大量的LncRNAs。LncRNAs 具有保守性低、表达量低和组织特异性强等特点[2-8]。例如，茄科中LncRNAs 的序列分析表明，不同物种中LncRNAs 的序列保守性很低。LncRNA-314在普通番茄和醋栗番茄中有特异性表达，而在潘那利番茄中则没有表达[9]。水稻LncRNAs 的全基因组鉴定和分析表明，与哺乳动物相比，LncRNAs 表达具有较高的组织特异性或阶段特异性[4]。青花菜（Brassica oleraceavar.italica）主要可食用部分为绿色花球，由肉质花茎和小花梗及绿色的花蕾群所组成[8]。花蕾的发育与青花菜的外观品质密切相关。而LncRNAs 在花蕾发育过程中起着重要的调控作用[6-10]。本研究通过前期的青花菜全基因组高通量测序选取了16 个LncRNAs 作为候选内参基因。利用geNorm、NormFinder 和BestKeeper 软件评估其在花蕾不同部位和不同发育时期中的表达稳定性，筛选适宜的内参基因，为进一步准确定量分析青花菜花蕾LncRNAs表达水平提供适宜内参。
1.1 材料
以青花菜高代自交系KU19-3 为材料，于开花期采集花蕾。花蕾不同部位分别为花梗、花萼、花瓣、雌蕊和雄蕊；
花蕾发育分为6 个时期，长度分别为1、2、3、4、5、6 mm。
1.2 方法
1.2.1 RNA 提取与cDNA 合成 青花菜总RNA 的提取按照植物RNA 提取试剂盒[宝日医生物技术（北京）有限公司]操作说明书进行。质量检测合格后，反转录合成cDNA第1链。
1.2.2 内参基因的选择与qRT-PCR 引物设计 在前期高通量测序的基础上，筛选了16个在细胞质雄性不育系及其保持系中表达相对稳定的LncRNAs（XLOC_000108、XLOC_000400、XLOC_007087、XLOC_008536、XLOC_008536、XLOC_010342、XLOC_012179、XLOC_015579、XLOC_021473、XLOC_025578、XLOC_029328、XLOC_030832、XLOC_034059、XLOC_034687、XLOC_037050和XLOC_039609）作为青花菜花蕾不同部位和不同发育时期的候选内参基因，各自引物序列见表1。
表1 16个候选LncRNAs引物序列及相关数据Tab.1 Primer sequences and related data of 16 candidate LncRNAs
续表1 16个候选LncRNAs引物序列及相关数据Tab.1（Continued）Primer sequences and related data of 16 candidate LncRNAs
1.2.3 候选内参基因qRT-PCR 扩增 qRT-PCR 在ABI 7500 上进行，反应体系和程序参照裴徐梨等[11]的方法。扩增反应结束后观察溶解曲线，检测引物的特异性。
1.2.4 标准曲线的绘制 将cDNA模板依次稀释10倍得到5 个梯度（1、10-1、10-2、10-3、10-4）。根据PCR得到的反应结果绘制标准曲线，并计算扩增效率（E），E=（10-1/slope-1）×100%，slope 为 标 准 曲 线 的斜率。
1.3 数据处理与分析
利用geNorm、NormFinder 和BestKeeper 软件对候选内参LncRNAs 进行数据处理和分析。geNorm和NormFinder 软件需先将平均循环阈值（ΔCt）转换为相对表达量Q 值（Q=E-ΔCt）才能进行数据输入，BestKeeper 软件可以直接输入qRT-PCR 得到的ΔCt值[9]。将3 个软件分别输出的平均表达稳定值M 和S、标准差SD 值进行表达稳定性排名，并对其求平均得出综合排名。
2.1 候选内参LncRNAs表达丰度分析
16 个候选内参LncRNAs 样品Ct 值都集中在19～30，表达丰度适中。在青花菜花蕾不同部位中，XLOC_034059（24.0、21.3、20.5、22.2、20.9）和XLOC_000108（24.4、22.5、21.2、23.7、24.1）的Ct 值最低。在青花菜花蕾不同发育时期中，XLOC_039609（20.2、21.6、21.2、21.2、21.1、22.8）和XLOC_034059（19.9、20.8、20.7、20.7、20.8、22.2）的Ct值最低（表2）。
表2 候选LncRNAs在青花菜花蕾样本中的Ct值Tab.2 Ct values of candidate LncRNAs in sample of flower bud of broccoli
续表2 候选LncRNAs在青花菜花蕾样本中的Ct值Tab.2（Continued）Ct values of candidate LncRNAs in sample of flower bud of broccoli
2.2 候选内参LncRNAs表达稳定性分析
2.2.1 geNorm 分析 在青花菜花蕾不同部位中，16个候选内参基因的平均表达稳定值（M 值）都小于标准值1.5，其中XLOC_000400和XLOC_008536的M 值为0.01，在16 个候选内参LncRNAs 中最低，表明这2个候选内参基因在不同部位中表达稳定性最高。XLOC_015579（M=0.75）的M 值最大，其次是XLOC_000108（M=0.60），两者表达稳定性较低（图1）。由geNorm 配对差异柱形图（图2）可知，配对变异值（V2/3）为0.068，小于0.15，表明最适合内参基因个数为2。综合上述结果，青花菜花蕾不同部位中表达最稳定的基因组合是XLOC_000400和XLOC_008536。
图1 geNorm 软件分析青花菜花蕾不同部位候选LncRNAs的表达稳定性Fig.1 Expression stability analysis of candidate LncRNAs in different parts of flower buds of broccoli by geNorm software
图2 geNorm软件分析青花菜花蕾不同部位候选LncRNAs的配对变异值Fig.2 Pairwise variation values of candidate LncRNAs in different parts of flower buds of broccoli by geNorm software
geNorm 分析结果显示，在青花菜花蕾不同发育时期中候选内参LncRNAs 的M 值，由高到低依次为XLOC_015579＞XLOC_034059＞XLOC_007980＞XLOC_030832＞XLOC_000400＞XLOC_012179＞XLOC_029238＞XLOC_007087＞XLOC_037050＞XLOC_010342＞XLOC_034687＞XLOC_025578＞XLOC_021473＞XLOC_039609＞XLOC_000108/XLOC_008536（图3）。
XLOC_015579的M 值为0.16，是16 个候选基因最大值，表明其不适合作为内参基因。XLOC_000108和XLOC_008536基因的M 值为0.02，为16个内参基因中最低。由geNorm 柱形图（图4）可知，配对变异值（V2/3）为0.023，小于0.15，表明最适内参基因个数为2。综合以上结果，青花菜花蕾不同发育时期表达适宜的内参组合是XLOC_000108和XLOC_008536。
图4 geNorm软件分析青花菜花蕾不同发育时期候选LncRNAs的配对变异值Fig.4 Pairwise variation values of candidate LncRNAs in different developmental stages of flower buds of broccoli by geNorm software
2.2.2 NormFinder分析 NormFinder软件分析结果（表3）表明，在青花菜花蕾不同部位中，XLOC_021473的平均表达稳定值（S 值）最小，为0.047，说明它的稳定性是最高的。其次是XLOC_034059（S=0.074）和XLOC_000400（S=0.149）。XLOC_015579的 S值最大，高达 1.149，最不稳定。
在青花菜花蕾不同发育时期中，XLOC_021473（S=0.030）的S 值最小，稳定性最高。其次是XLOC_039609（S=0.032）和XLOC_00108（S=0.033），而XLOC_015579（S=0.205）的S值最大，最不稳定（表3）。
表3 NormFinder软件分析候选LncRNAs在青花菜花蕾不同部位和不同发育时期的表达稳定性Tab.3 Expression stability analysis of candidate LncRNAs in different parts and different developmental stages of flower buds of broccoli by NormFinder software
2.2.3 BestKeeper 分析 在青花菜花蕾不同部位中，标准偏差（SD 值）较为稳定的LncRNAs 是XLOC_025578（SD=0.72）、XLOC_010342（SD=0.84）、XLOC_008536（SD=0.93）。此 外，最 不 稳 定 是XLOC_015579（SD=1.70）。表明XLOC_025578适合作青花菜花蕾不同部位的内参基因（表4）。
在青花菜花蕾不同发育时期 SD 值较小的LncRNAs 是XLOC_034059（SD=0.44）、XLOC_007980（SD=0.45）和XLOC_007087（SD=0.49）。此外，最不稳定基因是XLOC_037050和XLOC_000400（SD=0.62）。表明XLOC_034059适合作青花菜花蕾不同发育时期的内参基因（表4）。
表4 BestKeeper软件分析候选LncRNAs在青花菜花蕾不同部位和不同发育时期的表达稳定性Tab.4 Expression stability analysis of candidate LncRNAs in different parts and different developmental stages of flower buds of broccoli by BestKeeper software
2.2.4 3 个软件综合分析 3 个分析软件因算法不同，在花蕾的不同部位和不同发育时期中所得的结果有所差别。通过对3个软件的基因稳定性排名求平均得出综合排名，发现在花蕾不同部位中适宜的内参基因对是XLOC_000400（3.0）和XLOC_008536（3.3）（表5）。在花蕾不同发育时期中适宜的内参基因对为XLOC_039609（3.3）和XLOC_021473（3.7）（表6）。
表5 候选LncRNAs基因在青花菜花蕾不同部位综合排名Tab.5 Comprehensive ranking of candidate LncRNAs in different parts of flower buds of broccoli
表6 候选LncRNAs在青花菜花蕾发育不同发育时期综合排名Tab.6 Comprehensive ranking of candidate LncRNAs in different developmental stages of flower buds of broccoli
实时荧光定量PCR 是检测基因相对表达量的常用技术[12-13]，其准确性主要依赖于选择适宜的内参基因[14-15]。因此，筛选出合适的内参基因对研究青花菜花蕾不同部位和不同发育时期LncRNAs 的相对表达量尤为重要。本试验筛选LncRNAs 最佳内参基因，为青花菜花蕾不同部位和不同发育时期的研究提供适宜内参基因。
近年来大量的研究表明，基因的表达并不是绝对稳定的，任何内参基因的稳定性只是在一定的实验条件下保持相对稳定[16]。因此，本试验在青花菜花蕾不同部位和不同发育时期选择不同的基因作为内参基因是合理的。同时由于geNorm 和NormFinder、BestKeeper 3 个分析软件的算法不同，会导致3 个软件分析结果出现差异。因此，本研究综合各软件的稳定性排名选出在3个软件中稳定性均表现良好的基因作为内参基因。
前人报道指出，选择2 个或2 个以上的内参基因可以减少单一内参基因带来的误差，提高结果的准确性[17-18]。本研究发现，在青花菜花蕾不同部位中最稳定的内参基因组合数为2 个，在青花菜花蕾不同发育时期最佳内参基因数也为2个。本研究通过geNorm 配对变异值分析发现，在花蕾不同部位组和不同发育时期组中，内参组合Vn/（n＋1）值均小于程序推荐值0.15。表明本研究中选择的16 个内参基因差异较小，此时选择2个内参基因来校正试验，可以减少单一内参基因带来的误差[19-20]。
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