人乳头瘤病毒分子生物学检验技术的研究进展

刘小莲

贺州广济医院 广西 贺州 542800

人乳头瘤病毒（HPV）是一类多空病毒科、乳头瘤空泡病毒A属20面体DNA病毒，HPV基因组中含有8000bp双链环状DNA。所有的开放阅读框（ORFs）全部是一条DNA链编码，可划分成3个区域：非编码上游调控区（URR），早期转录基因主要包括E6、E7、E1、E2、E4、E5，晚期转录基因L1、L2[1]。早期转录基因和DNA复制相关，晚期转录基因编码衣壳蛋白可促使病毒DNA步入细胞。HPV是造成人体皮肤黏膜鳞状上皮增殖，病毒步入皮肤黏膜后，主要潜伏在表皮内基底细胞内，等条件成熟后就会发病[2]。为尽早确诊宫颈疾病，已有很多建立在分子生物学方式的HPV检测技术问世。本研究总结分析人乳头瘤病毒分子生物学检验技术的进展。

子宫颈癌是女性的恶性肿瘤，全球范围中每年发病人数较多，我国占1/4，尤其是农村偏远其余。临床急需开发一类应用便捷，费用低廉的诊断技术。当下，医学界依然认为宫颈癌的发病和高危型HPV感染有一定关系[3]。子宫癌的发生、发展过程比较缓慢，即开始是宫颈上皮内瘤变（CIN），且以CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ期渐进过程呈现，还会可逆性缓缓消退，经历时间较短长。所以，美国癌症协会（ACS）、美国阴道镜与宫颈病理学会（ASCCP）、与美国临床病理学协会（ASCP）结合早期检查HPV，为子宫癌的预防开辟路径[4]。

高危型HPV持续性感染只有HPV含量达到一定水平，方会造成细胞学变化、癌前病变。但是，很多感染HPV的女性并未发展为CINⅡ-Ⅲ期，而是在自身免疫的调节作用下清除HPV。我国人群中，HPV感染型别地区差异甚大，北京地区会感染HPV 16、58、33、43、56型，浙江地区的感染主要是HPV 52、16、58、68型，云南区域主要感染HPV 16、56、58、33、52型[5]。

HPV无法在体外培养，当前的检测技术主要是以分子生物学法。

2.1 建立在信号扩增技术测定HPV

杂交捕获技术是建立在信号扩增上有效的HPV技术，临床目前所用的HC-Ⅱ HPV DNA测定试剂盒为此技术的典型代表。用微孔板体外开展核酸杂交，借助化学发光信号放大方式定性测定样品中多种高危型的HPV DNA[6]。这种方式全长RNA探针，不会因病毒产生变异对检测数据造成影响，基因不需要扩增，试验条件不需要特殊，操作简单，实验污染概率会降低。世界诸多实验室研究得出：高危型阳性阈值为1pg /mL，对宫颈病变引起的敏感性进行筛查后高达93.6%。HC-Ⅱ HPV DNA为最早应用美国食品、药品监督管理局（FDA）所证的HPV测定产品，试剂价格昂贵，测定成本高。

高危型HPV DNA测定试剂盒（HPV HR）用酶切信号放大法，定性对14种高危型进行检测。这种试剂盒的不足之处为无法明确具体型号；
对HPV 67、70会产生交叉反应，引起假阳性。试剂费用较高，测定成本略高[7]。Cervista HPV 16 /18测定原理与Cervista HPV HR接近，其所测定的基因型HPV16、HPV 18、70%子宫癌发生相关。这些产品均是建立在信号放大的基础上定性测定HPV DNA，因不会影响基因扩增，一定程度规避假阳性。

2.2 建立在模板扩增技术测定

HPV经PCR技术来测定HPV DNA模板，检测灵敏度较高，但这仅局限在理论上，实践尚需进一步研究。样本上10-100拷贝DNA即可检出[8]。但这种方式的灵敏度、特异度受样本运输、保存条件来提取DNA，引物设计与PCR程序的干扰，假阳性率较高。

2.2.1 1型特异性PCR、通用引物PCR

PCR型特异性PCR所针对的是单一型号的HPV所涉及的特异性引物开展PCR扩增，每次试验仅可检测一类基因型，分析此基因型型号，但若测定多个HPV基因型别需设计较多的特异性PCR引物，操作程序繁杂，价格较高[9]。现渐渐通用引物PCR法替代，通用引物PCR为HPV基因保守区L1区。通用引物经设计后扩增，一次试验会测定较多的HPV基因型。通用引物PCR扩增时会导致引物错误搭配，有效预防退火温度的上升，以免出现假阳性。当下，最常用的3种通用引物分别是My 09/11、GP5 +/6 +、SPF10，产物的扩增长度分别是450 bp、150 bp、65 bp[10]。扩增产物的大小是影响扩增效率的主要原因，扩增产物片段较小，扩增效率较高。因此，设计引物时，需结合灵敏度需求来评估，扩增产物测定需用琼脂糖胶电泳，灵敏度不佳，数据不易保存。

2.2.2 实时荧光定量PCR

PCR技术是在定性基础上发展而来的核酸定量技术。虽然，目前依然难以实现一个PCR反应管中对多个型特异性引物进行测定，但通用引入已广泛在实时荧光定量PCR展开测定。实时荧光定量PCR主要分成单通道、多通道[11]。前者是在反应管中应用一类荧光物示踪，操作比较简单，但每次依然仅能测一项基因。后者是用诸多不同激发/发射波长荧光物质标记特异性探针示踪，可在相同反应管中测定各基因型别。AB Analitica公司生产的高危型HPV分型、定量试剂盒充分运用PCR-荧光探针法引导内参照。多通道和标本实施PCR扩增，消除取样误差[12]。这种方式的不足之处是操作繁杂，对部分型难以分型。Cobas HPV测定试剂盒应用实时荧光定量PCR技术与核酸杂交技术联合对多种高危型进行检测，实现HPV16、18可分型[13]。这种方式的特征是用全自动方式提取目标核酸，做好前期准备，为后续的PCR与核酸杂交提供便利条件，以免因人工操作造成误差。其不足之处是需准备特殊仪器，花费成本较高，不利于推广。

此方法荧光信号对产物进行检测，不仅可使灵敏度提高，还可每次PCR循环对数据进行搜集，创建实时扩增曲线，准确掌握定域值循环数（CT），从起始数值实现真实的DNA定量。因PCR扩增、产物分析均在相对封管中开展，可充分减少污染概率。这种方式灵敏度、特异度、准确度均较高，线性范围广泛，操作简单，且安全性高，无PCR后处理方式，当前已在hr-HPV DNA检测应用。薛鹏[14]等学者用这种方式测定的HPV疣体组织中的HPV等型进行检测，取得灵敏度、特异度、准确度均较高，简单方便。此方式的工作原理是用应光能量传递技术在PCR反应体系中添加荧光探针，在全部PCR反应期间，荧光定量PCR仪即可持续不断测定反应体系中荧光信号变化量，等其增加到对应阈值时对应的PCR循环次数会被记录下来。实时荧光定量PCR技术在临床与生命科学研究各领域中应用，在科研方面定量各类基因的表达分析，提高检测准确性。

2.2.3 RT-PCR

罗保斌[15]等学者用RT-PCR法测定HPV E6 /E7 mRNA，尽早会发现HPV感染。APTIMA HPV基因分型为利用RT-PCR技术对14类高危型HPV进行检测。但这种方法同样有弊端，难以对具体型别进行确定。

建立在模板扩增技术检测出的灵敏度较高，会检测出10-100拷贝HPV DNA，这类低含量的病毒感染需借助自身免疫力，以免引起临床对应病变。只有当HPV含量到达一定水平方会造成细胞学变化，引起癌前病变。灵敏度较高的测定方式在临床容易造成假阳性数据，避免其引起心理上的恐慌。宫颈产生高度病变时，整合病毒事易产生目标片段变异，应用模板扩增技术来测定，容易漏诊。模板扩增技术有一定局限性，如：有一定的假阳性占比，还存在交叉污染问题，操作复杂，应用局限性大。

3.1 宫颈癌与癌前病变筛查

有研究[16]经对HPV16、18、31、33开展PCR检测，同时对宫颈涂片、活检标本进行分析，病历诊断数据与HPV感染状况开展相关性分析。数据说明HPV阳性率和高度鳞状上方皮内病变（HSIL）组织细胞病理诊断呈相关性。还得出HPV测定数据阳性ASCUS和组织学异常对应，但HPV阴性者不同。所以，说明高危HPV-DNA检测在宫颈癌初筛中可充当巴氏涂片有利对诊断进行辅助。

有研究[17]通过对比HPV-DNA测定、细胞学、阴道镜检查在高度宫颈上皮内瘤变（CINⅡ、CINⅢ）、癌变患者初筛中的效用，表示对中年妇女开展高危HPV-DNA测定，结果呈阴性时，宫颈癌预防性筛查时间可得到延长。

有研究[18]用HC-Ⅱ技术测定高危HPV型别，预测巴氏涂片上反复产生ASCUS、低度鳞状上皮内病变（LGSIL）者有CINⅡ、CINⅡ可能性。这说明高危HPV阳性数据和CINⅡ、CINⅢ是高度相关性。

3.2 宫颈病变治疗后癌前预报

有研究[19]对收治的75例CINⅡ、CINⅢ患者开展前瞻性研究，为患者开展锥切术后有选择的决定是否开展子宫切除。手术在开展前与切除子宫时均需开展HC-Ⅱ系统开展高危HPV-DNA测定。发现子宫切除术前采用宫颈拭子取得的细胞中，其HPV-DNA状况和子宫切除术残余病变对用。说明开展锥切术后开展HPV-DNA监测对残余的宫颈上皮内瘤变有预测效果，灵敏度与阴性预告值均较高。

有研究[20]经对CINⅡ、CINⅢ患者处理后开展高危HPV-DNA检测，发现处理后半年时所测的高危HPV阳性率比细胞学异常数据预测价值更高。特异性接近时，灵敏度为90%、62%。

综上所述，HPV DNA测定与分型技术的高速发展下，宫颈癌、癌前可进行预防与筛查，在诊断与预后上发挥作用显著。宫颈癌高发区域，HPV测定联合细胞学测定检查宫颈癌价值较高。较之发达国家，我国宫颈癌防治中的不足是性能不佳，价格较低，容易普及，尽早开展筛查，选择质量高的诊断试剂，不断改进不足之处，实现检测技术的创新。

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